血藍(lán)蛋白
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hemocyanin；haemocyanin
又稱血清素。
它是在某些軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物(蜘蛛和甲殼蟲)地血淋巴中發(fā)現(xiàn)地一種游離的藍(lán)色呼吸色素。血藍(lán)蛋白含兩個(gè)直接連接多肽鏈的銅離子,與含鐵的血紅蛋白類似,它易于氧結(jié)合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結(jié)合的銅蛋白，氧化時(shí)呈青綠色，還原時(shí)呈白色。其分子量450 000～130 000。節(jié)肢動(dòng)物的血藍(lán)蛋白一條多肽鏈與一分子氧結(jié)合，含銅量0．17％；軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白一條多肽鏈則與6分子氧結(jié)合，含銅量0.025％。銅以二價(jià)形式與蛋白直接結(jié)合。血藍(lán)蛋白有多種催化作用，特別是變性后，在特定條件下具有多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶和脂氧化酶等活性。
在一些無(wú)脊椎動(dòng)物中，多數(shù)動(dòng)物的血液不含血紅蛋白，如軟體動(dòng)物（頭足動(dòng)物和石鱉屬等）以及節(jié)肢動(dòng)物（蝦、蟹及肢口綱的鱟）所含的是血藍(lán)蛋白（亦稱為血藍(lán)素）。血藍(lán)蛋白分子由Cu2+和1個(gè)約200個(gè)以上氨基酸的肽鏈結(jié)合而成，和血紅蛋白一樣，該呼吸色素的顏色也與其狀態(tài)有關(guān)，在氧和狀態(tài)下為藍(lán)色，在非氧和狀態(tài)下則為無(wú)色或白色。
關(guān)鍵詞：載氧功能；抗病毒活性；抗菌活性；凝血功能
血藍(lán)蛋白是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無(wú)色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色。分子質(zhì)量一般為50 ku～75 ku，由7個(gè)或8個(gè)功能單位組成圓柱形結(jié)構(gòu)。組成血藍(lán)蛋白的亞單位數(shù)目較多，每個(gè)亞單位都含有2個(gè)Cu(Ⅰ)離子。不同蛋白質(zhì)所含亞單位數(shù)目不同，有些血藍(lán)蛋白的分子質(zhì)量可達(dá)9×103 ku。軟體血藍(lán)蛋白是圓柱狀分子，含有10個(gè)～20個(gè)亞單位，每個(gè)亞單位(分子質(zhì)量為350 ku～450 ku)有7個(gè)～8個(gè)功能單元(氧分子結(jié)合部位)。節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白由六聚體或多個(gè)六聚體組成，分子質(zhì)量約為3.5×103 ku，每個(gè)亞單位(分子質(zhì)量為7.5 ku)含有一個(gè)氧合中心。血藍(lán)蛋白的主要生物學(xué)功能與機(jī)體內(nèi)的輸氧有關(guān)，它與血紅蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血紅蛋白(hemerythreins)并稱為動(dòng)物界中的3種呼吸蛋白。但近年的研究表明，血藍(lán)蛋白是一種多功能蛋白，它不僅具有輸氧功能，而且還與能量的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過(guò)程的調(diào)節(jié)有關(guān)。特別引起學(xué)術(shù)界重視的是，血藍(lán)蛋白還具有酚氧化物酶活性和抗菌功能，被認(rèn)為是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物中的一種重要的免疫分子。
1 血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
血藍(lán)蛋白是蝦血淋巴中的含銅呼吸蛋白，每個(gè)氧結(jié)合位點(diǎn)有2個(gè)銅原子，其氧的結(jié)合位點(diǎn)與另一種銅離子結(jié)合蛋白——酚氧化酶的氧結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)具有很高的相似性。血藍(lán)蛋白在脫氧狀態(tài)為無(wú)色，結(jié)合氧為藍(lán)色。
柱結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)及電鏡技術(shù)，研究中國(guó)鱟魚血藍(lán)蛋白(hemocyanin)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)果表明經(jīng)Sephadex G-100純化的血藍(lán)蛋白在PAGE電泳中出現(xiàn)4個(gè)條帶]，純化的血藍(lán)蛋白再經(jīng)DEAE-32層析得到5個(gè)洗脫峰，每個(gè)峰在PAGE電泳下可分辨出4個(gè)條帶，電鏡下，血藍(lán)蛋白分子出現(xiàn)環(huán)形、五角形、十字形和蝴蝶結(jié)形等構(gòu)型并與其他解離的中間的構(gòu)型同時(shí)存在。
節(jié)肢動(dòng)物門的螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛中都含有血藍(lán)蛋白，其中最大的類群昆蟲雖不存在血藍(lán)蛋白，但含有與血藍(lán)蛋白有同源關(guān)系的六聚蛋白(hexamer)。六聚蛋白又分為富含芳香族氨基酸的和富含甲硫氨基酸的兩個(gè)類群。在節(jié)肢動(dòng)物的近親有爪類(Onychophora)中也發(fā)現(xiàn)了節(jié)肢動(dòng)物類型的血藍(lán)蛋白。節(jié)肢動(dòng)物類型的血藍(lán)蛋白有四級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。血藍(lán)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為75 ku，其中第2個(gè)域?yàn)棣谅菪齾^(qū)，螯合1對(duì)Cu＋，可結(jié)合1個(gè)O2，下方為第3個(gè)域，由β折疊塊構(gòu)成并含有Ca離子，功能尚不詳。
節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白至少已分化成為：①酚氧化酶原(prophenoloxidase)；②昆蟲的六聚蛋白(hexamer)，不螯合Cu＋，為貯藏蛋白；③甲殼類的假血藍(lán)蛋白(pseudohemocyanin或cryptocyanin)，也為貯藏蛋白；④雙翅類的六聚蛋白受體。經(jīng)分子系統(tǒng)學(xué)的分析，它們與血藍(lán)蛋白相聚，共同構(gòu)建了節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白基因超家族。
2 血藍(lán)蛋白的功能
血藍(lán)蛋白的載氧功能
血藍(lán)蛋白是以一價(jià)銅離子作為輔基的蛋白質(zhì)。它存在于軟體動(dòng)物(如章魚、烏賊、蝸牛等)和節(jié)足動(dòng)物(如螃蟹、蝦、蜘蛛等)的血液里。血藍(lán)蛋白的生理功能是輸氧。氧合血藍(lán)蛋白的銅是Cu(Ⅱ)并呈藍(lán)色，在347 nm附近有吸收峰，這是由扭曲四面體場(chǎng)中的d-d躍進(jìn)產(chǎn)生的。脫氧血藍(lán)蛋白呈無(wú)色。X射線衍射技術(shù)大大增加了人們對(duì)血藍(lán)蛋白的認(rèn)識(shí)。雖然目前仍未測(cè)出軟體血藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但為節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析提供了血藍(lán)蛋白分子活性部位的結(jié)構(gòu)信息。龍蝦血藍(lán)蛋白亞單位由3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成。區(qū)域Ⅰ為蛋白的前175個(gè)氨基酸殘基組，有大量的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)；區(qū)域Ⅱ大部分也為α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，由225個(gè)氨基酸殘基(176個(gè)～400個(gè))和作氧分子鍵合部位的雙銅離子組成；剩余的258個(gè)氨基酸殘基(401個(gè)～658個(gè))構(gòu)成區(qū)域Ⅲ，并且類似于如超氧化物歧化酶等其他蛋白的β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)。在區(qū)域Ⅱ的雙銅活性中心中，每個(gè)銅離子與3個(gè)組氨酸殘基的咪唑氮配位。未氧合時(shí)，2個(gè)銅離子相距約46 pm，相互作用很弱，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2個(gè)銅離子之間存在著蛋白質(zhì)本身提供的橋基。此時(shí)，每個(gè)銅離子與3個(gè)組氨酸殘基咪唑氮的配位基本上是三角形幾何構(gòu)型。氧合后，Cu(Ⅱ)為四配位或五配位，兩個(gè)銅離子與兩個(gè)氧原子(過(guò)氧陰離子)和6個(gè)組氨酸殘基中最靠近銅離子的4個(gè)組氨基酸殘基咪唑氮強(qiáng)配位。此時(shí)，在一個(gè)近似的平面上，每個(gè)銅離子呈平面正方形幾何構(gòu)型，這是Cu(Ⅱ)最有利的配位狀況。氧分子以過(guò)氧橋形式在連接兩個(gè)Cu(Ⅱ)，兩個(gè)Cu(Ⅱ)相距約36 pm。
化學(xué)家對(duì)合成血藍(lán)蛋白的模型化合物頗感興趣。1978年Simmons M G和Wilson L J合成了以咪唑作為配體的Cu(Ⅰ)配合物，在室溫下無(wú)論是溶液或固體都能可逆載氧。用2,6-二乙酰基吡啶與組胺縮合，得到配體2,6-[1-(2-咪唑-4-亞乙基亞氨基)乙基]吡啶，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入[Cu(Ⅰ)(MeCN)4](ClO4)得到暗紅色的[Cu(Ⅰ)](ClO4)配合物。
該配合物在溶液中以單體形式存在。Cu(Ⅰ)離子的配位數(shù)為5。在室溫下露置于空氣中，溶液迅速?gòu)募t色變?yōu)榫G色，約2 min后反應(yīng)完全，每2 mol Cu(Ⅰ)吸收1 mol O2。如果把載氧后的溶液對(duì)蝦(Penaeus monodon)血清中分離出2種能與白斑桿狀病毒(White spot syndrome virus ，WSSV)和虹彩病毒(Singapore grouper irido virus，SGIV)結(jié)合的多肽，分子質(zhì)量分別為73 ku和75 ku，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定為血藍(lán)蛋白，將血藍(lán)蛋白和病毒混合后添加到細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞只受到較輕微的破損。而不含血藍(lán)蛋白的對(duì)照組細(xì)胞則完全裂解。如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，試驗(yàn)組細(xì)胞也相繼裂解。隨后選用6種DNA 或RNA病毒(SGIV、FV3、LDV、ThRV、ABV和IPNV)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其半抑制濃度(Semi-inhibitory concentration，ECs)約為4.56 mg/L～6.64 mg/L。這些結(jié)果表明，血藍(lán)蛋白在低濃度時(shí)是潛在的病毒抑制物，但血藍(lán)蛋白不能完全抑制病毒的復(fù)制。
研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白的兩個(gè)亞基在免疫功能上有很大差異，Lei K Y等報(bào)道，血藍(lán)蛋白的兩個(gè)分子質(zhì)量73 ku和75 ku的亞基，只有75 ku的PjHcL亞基具有抗病毒功能，PjHcY亞基不具有抗病毒功能，它意味著這兩個(gè)血亞基可能起不同的角色。從序列和結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，盡管這兩個(gè)亞基是高度保守的，它們表現(xiàn)出一定的差異在N端域和C端域。比對(duì)兩個(gè)亞基的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在銅離子結(jié)合位點(diǎn)及第2功能區(qū)兩個(gè)亞基結(jié)構(gòu)完全相同，只有在第3功能區(qū)PjHcL亞基和PjHcY亞基的氨基酸α、β構(gòu)型不同。Lei等采用RT-PCR技術(shù)精確驗(yàn)證了這一結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)亞基的不同免疫功能，為以后研究血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)功能提供了更明確的依據(jù)。
總之，血藍(lán)蛋白的免疫防御功能是近年來(lái)無(wú)脊椎動(dòng)物免疫學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)中，僅可表現(xiàn)出酚氧化酶的功能，而且可裂解產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的抗菌片段以抵御病原的入侵。雖然其免疫機(jī)理目前尚不十分明確，但隨著無(wú)脊椎動(dòng)物上的演變相信其確實(shí)情況必將闡明。
血藍(lán)蛋白的血凝作用
近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，血藍(lán)蛋白及其裂解片段具有多種免疫功能。章躍陵以采自汕頭的南美白對(duì)蝦為研究對(duì)象，采用親和層析、PAGE、SDS-PAGE、Western blot、血細(xì)胞凝集試驗(yàn)和糖抑制試驗(yàn)等方法探索南美白對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的血細(xì)胞凝集活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白對(duì)試驗(yàn)所選用的魚、雞、鼠和人等4種紅細(xì)胞均具有顯著的血細(xì)胞凝集活性，凝集活性大小為5 mg/L～10 mg/L，而且其凝集反應(yīng)可被α-半乳糖、α-D葡萄糖、甘露醇和N-乙酰神經(jīng)氨酸等4種糖所顯著抑制。不過(guò)，與一般的凝集素相比，血藍(lán)蛋白的凝集活性大概低1個(gè)～2個(gè)數(shù)量級(jí)，它在蝦血清中含量上的豐富也許可以彌補(bǔ)其凝集活性上的不足。既往研究中，發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)量譜峰值可以與流感病毒的血凝素相匹配，其序列覆蓋率為37%。由此推測(cè)，血藍(lán)蛋白確實(shí)具有血細(xì)胞凝集活性，這對(duì)進(jìn)一步研究血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)功能具有重要意義。
研究證實(shí)，血藍(lán)蛋白可能由酚氧化酶進(jìn)化而來(lái)，酚氧化酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的激活又與甲殼動(dòng)物體內(nèi)凝血蛋白的凝血機(jī)制緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白也具有凝集活性。這些研究結(jié)果提示，血藍(lán)蛋白、酚氧化酶及凝血蛋白可能是由同一蛋白進(jìn)化而來(lái)，而血藍(lán)蛋白這一多功能分子卻保留了它們?nèi)康拿庖邔W(xué)功能。
血藍(lán)蛋白的抗菌作用
血藍(lán)蛋白裂解產(chǎn)生的抗微生物肽與對(duì)蝦的免疫反應(yīng)有關(guān)。近來(lái)又在大西洋白對(duì)蝦和凡納對(duì)蝦的血淋巴中分離到3種帶負(fù)電荷的抗真菌活性肽類，與血藍(lán)蛋白C端序列的一致性達(dá)95%～100%。當(dāng)對(duì)蝦被感染后，血淋巴中這種血藍(lán)蛋白C端序列的活性肽濃度升高，這表明血藍(lán)蛋白的裂解是由生物學(xué)信號(hào)引起的。Lee S Y等從淡水螯蝦血漿中得到一種由16個(gè)氨基組成的抗菌肽，能抑制G＋和G－細(xì)菌的生長(zhǎng)。這種抗菌肽是血藍(lán)蛋白在酸性條件下經(jīng)蛋白酶剪切產(chǎn)生。注射脂多糖和葡聚糖可促進(jìn)血藍(lán)蛋白產(chǎn)生和釋放這種肽。這說(shuō)明抗微生物肽可以被誘導(dǎo)、釋放和激活，從而在肌體的免疫防御中起作用。Zhang Y L等還在凡納對(duì)蝦血清中分離到一種能與羊抗人IgG特異性反應(yīng)的IgG樣蛋白，經(jīng)檢測(cè)為血藍(lán)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，除銅結(jié)合位點(diǎn)外，在此血藍(lán)蛋白的C端還存在一個(gè)由252個(gè)氨基酸組成的似Ig的保守區(qū)域。此外，還在血藍(lán)蛋白和Ig的重鏈和k鏈分別發(fā)現(xiàn)4個(gè)和1個(gè)相似保守區(qū)域。很有可能這些相似Ig的保守區(qū)域賦予了甲殼動(dòng)物呼吸色素新的功能，使其更好地發(fā)揮抗微生物作用。雖然到目前為止，血藍(lán)蛋白的加工機(jī)制還不十分清楚，但它們?cè)诩讱?dòng)物免疫系統(tǒng)中所起的作用不容忽視，因此進(jìn)行深入細(xì)致的研究，搞清楚其免疫機(jī)制，對(duì)于甲殼類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的疾病控制是至關(guān)重要的。
近年來(lái)，隨著血藍(lán)蛋白多種功能的不斷發(fā)現(xiàn)，特別是免疫活性的發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白的功能、作用機(jī)理、進(jìn)化地位已經(jīng)引起各國(guó)學(xué)者的濃厚興趣。進(jìn)一步研究血藍(lán)蛋白功能對(duì)于豐富和發(fā)展無(wú)脊椎動(dòng)物，特別是甲殼類動(dòng)物生理生化和免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究，探索免疫這些結(jié)果表明，血藍(lán)蛋白具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒功能及獨(dú)特的作用機(jī)理，有可能成為抗菌、抗病毒及抗腫瘤藥物的新來(lái)源。我國(guó)是海洋大國(guó)，開發(fā)和利用海洋動(dòng)物血藍(lán)蛋白資源，將為研制抗菌新藥提供理想分子設(shè)計(jì)骨架和模板，為發(fā)展新的抗感染藥物奠定重要基礎(chǔ)。此外，蝦類血藍(lán)蛋白的研究加深了人們對(duì)低等脊椎動(dòng)物免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為日益嚴(yán)重的蝦類病害防治開辟了嶄新的途徑。同時(shí)，隨著蝦類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們有可能通過(guò)轉(zhuǎn)血藍(lán)蛋白基因獲得抗病新品種。可以相信，隨著研究的不斷深入，蝦類血藍(lán)蛋白將對(duì)世界水產(chǎn)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到重要的作用。
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