基因診斷與性病/艾滋病診斷
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一、診斷依據(jù)：
（一）流行病學及臨床表現(xiàn)
（二） 實驗室檢查
（1）主要是中度以上細胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴細胞耗竭：T淋巴細胞功能下降，外周血淋巴細胞顯著減少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人為1.25～2.1），遲發(fā)型變態(tài)反應皮試陰性，有絲分裂原刺激反應低下。
（2）B淋巴細胞功能失調(diào)：多克隆性高球蛋白血癥，循環(huán)免疫復合物形成和自身抗體形成。
（3）NK細胞活性下降
（4）各種致病性感染的病原體檢查如PCR。組織學證實的惡性腫瘤，如KS；
1.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）；2.明膠顆粒凝集試驗（PA）；3.免疫熒光檢測法（IFA）；4.免疫印跡檢測法（Western Blot，簡稱WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三項常用于篩選試驗，后二者用于確證試驗。HIV感染后數(shù)周或數(shù)日內(nèi)常不能檢出抗體，95%的受染者在5個月內(nèi)可測出抗體。但也有感染后3-4年仍不能檢出抗體者，此時有必要檢測HIV病毒。
（四）PCR技術(shù)檢測HIV病毒
1．標本的采集與模板核酸的制備。從懷疑為AIDS和ARC患者以及無癥狀的同性戀者采集血液標本，分成兩份，其中一份送往檢測實驗室與Glyciegel混合進行常規(guī)檢驗或者在-20～-80℃保存。另一份可在凍存之前通過聚蔗糖（Ficoll）離心分離，收集沉積細胞。此法亦適用于疑為HIV感染的母親及出生6個月以上的新生兒的血液標本。
可采用下述方法自血液標本中分離外周血單核細胞（PMC）：
① 取4ml血液用Hanks液1：1稀釋。
② 向含有1份淋巴細胞分離液的試管內(nèi)輕輕加入兩分稀釋的血液，勿攪亂分層。
③ 2500r/min離心20min。
④ 吸出介于淋巴細胞分散液和血漿層間的PMC層，再用Hanks液洗兩遍。
⑤ 加入RPMI-1640生長液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使細胞濃度為2×106/ml。
⑥ 置5%CO2的孵箱內(nèi)于37℃培養(yǎng)2～3d，作為HIV分離的靶細胞。
2．模板核酸的提取。制備PCR模板核酸有多種方法，但其基本原理大致相同，使用的試劑因采取的方法不同而異。這里分別介紹兩種從外周血單核細胞中提取DNA和RNA的方法。
（1）從外周血單核細胞中提取DNA
方法A：
①取1ml經(jīng)37℃快速解凍的Glyciegel凍存細胞置一支小離心管內(nèi)。
②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。
③2500r/min離心10min，棄上清。
④沉淀的細胞用PBS洗兩次，最后將細胞懸浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使細胞濃度為6×106/ml。
⑤加入等體積的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。
⑥ 于37℃保濕后置冰箱保存。
該方法也適用于無Glyciegel保存的肝素標本及新鮮樣品經(jīng)聚蔗糖-400離心制備的淋巴細胞DNA的提取。
方法B：
①取4ml經(jīng)37℃快速解凍的Glyciegel標本。
②2500r/min離心10min，收集沉淀的細胞，上清液可作血清學研究用。
③用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）將沉淀的細胞洗一次。
④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗兩次。
⑤通過聚蔗糖-400離心，分離單核細胞。
⑥將單核細胞懸浮于0.5ml裂解緩沖液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使細胞裂解。
⑦用酚一氯仿抽提兩次，將水相轉(zhuǎn)移到一支新的離心管內(nèi)。
⑧加入3倍體積的無水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min離心10min，棄上清，沉淀物經(jīng)真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。
該方法也適用于標本經(jīng)聚蔗糖-400離心制備的單核細胞DNA的提取。
（2）從外周血單核細胞中提取RNA及其反轉(zhuǎn)錄
方法A：
① 5ml血液標本，通過聚蔗糖-400離心制備外周血單核細胞。
② 將細胞懸浮于10mlRPMI-1640離心制備外周血單核細胞。
③ 2500r/min離心20min，收集沉積細胞。
④把細胞懸浮于一定體積的預冷的裂解緩沖液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使細胞濃度為104/ml。
⑤ 13000r/min，于4℃離心10min，收集上清液。
⑥ 把含有RNA的上清液轉(zhuǎn)移到一支新管內(nèi)，立即置-80℃保存，備用。
在RNA反轉(zhuǎn)錄前，先將RNA樣品用DNase處理，除去樣品中殘留的DNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA即可進行PCR擴增。RNA反轉(zhuǎn)錄操作如（7）～（9）。
⑦ 取10μlRNA樣品加2.7UDNase I。
⑧ 于37℃保溫10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷卻。
⑨ 另將一份DNase I處理過的RNA樣品，加入RNase A（15μg/份），37℃保溫10min，置-20℃保存。
方法B：
①取5ml新鮮血漿置一支離心管內(nèi)。
②40000r/min，4℃離心10min，收集沉淀。
③將沉淀物溶于變性液（4.0mmol/L異硫氰酸胍,25mmol/L檸檬酸緩沖液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巰基乙醇）中充分混勻.
④加入30μl2mmol/L乙酸鈉緩沖液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/異戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.
⑤13000r/min離心20min.
⑥輕輕將水相轉(zhuǎn)移到一支新管中.
⑦加入3倍體積的無水乙醇,-20℃放置1h左右.
⑧13000r/min,4℃離心15min,收集沉淀.
⑨沉淀物用75%乙醇洗滌兩次,真空干燥.
⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反轉(zhuǎn)錄.
⑾ 取10μl RNA樣品.
⑿ 加入10μl 1×PCR緩沖液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明膠),各0.2mmol/L四種dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制劑(RNsin),10U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
⒀ 42℃保溫30～60min,然后93℃5min.
⒁ 立即置冰浴中冷卻，備用。
由上述方法制得的RNA反轉(zhuǎn)錄樣品，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳可鑒定其特異性。
二、PCR擴增步驟
（一）引物的設計與合成
HIV PCR引物設計應遵尋引物設計的一般原則。由于HIV基因易發(fā)生變異，因而引物應在保守區(qū)內(nèi)設計，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列內(nèi)設計，HIV感染的細胞往往很少，要從106個正常細胞中檢出1個HIV感染細胞，PCR擴增的引物首先要具有特異的結(jié)合HIV相應基因能力，同時一般要采用巢式-PCR方法，來提高檢測的靈敏性。
檢測HIV引物的第二步驟就是擴增HIV感染細胞中的原病毒DNA。感染細胞與未感細胞混合得到連續(xù)的10倍感染細胞的稀釋液。通常由103/106個感染細胞稀釋至1/106個感染細胞。同時用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的DNA作對照，進行PCR擴增。然后通過Southern雜交及DNA序列分析，進一步確定擴增產(chǎn)物的特異性。
已經(jīng)被確定的保守區(qū)是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于臨床標本檢測之前，要對引物的特異性進行鑒定。通常取100pg含有HIV基因組序列的質(zhì)粒DNA稀釋液和2μg載體鯡魚精DNA。如引物是特異的，它們就會指導單一的雙股DNA片段的合成。合成的DNA片段相對應于兩引物5′末端之間距離。如果是另一種DNA模板，就不會合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所預期的或除了有所預期的片段還有其它的DNA片段，那么可以考慮對PCR的條件進行某些改進，看是否能改善其特異性，否則要另選引物。
表6-20 用于HIV PCR擴增的引物及探針
| 引物及探針 | 序列（5′3′） | 基 因區(qū) | 片段（bp） |
| SK38 | ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT | gag | 115(HIV1) |
| SK39 | TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC | ||
| SK19(P) | ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC | ||
| SK145 | AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT | gag | 141(HIV1) |
| SK101 | GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC | 139(HIV2) | |
| SK102(P) | GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT | ||
| SK145 | AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT | gag | 142(HIV1) |
| SK150 | TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC | 139(HIV2) | |
| SK102(P) | GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT | ||
| O-1 | GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC | gag | 525(HIV1) |
| O-2 | TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC | ||
| I-2 | TTGGTCCTTGTCTTATGTCC | gag | 422(HIV1) |
| I-1 | TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC | ||
| GK55 | CCTGCTATGTCACTTCCCCT | gag | 190(HIV1) |
| GK56 | TTATCAGAAGGAGCCACCCC | ||
| P-1 | TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT | pol | 355(HIV1) |
| P-2 | TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA | ||
| SK29 | ACTAGGGAACCCACTGCT | Itr | 105(HIV1) |
| SK30 | GGTCTGAGGGATCTCTA | ||
| SK31(P) | ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT | ||
| P13 | TGGCGCCCGAACAGGGAC | LTR | 168 |
| P14 | TACCCACGCTCTCGCAG | ||
| SK89 | AGGAGCTGGTGGGGAACG | LTR | 165(HIV2) |
| SK90 | GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA | ||
| SK91(P) | TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG | ||
| SK68 | AGCAGCAGGAAGCACTATGG | env | 142(HIV1) |
| SK69 | CCAGACTGTGAGTTGCAACAG | ||
| SK70(P) | ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT | ||
| CO1 | ACAATTATTGTCTGGTATAG | env | 135(HIV1) |
| CO2 | AGGTATCTTTCCACAGGCAG | ||
| CO3(P) | TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG | ||
| CO71 | TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA | env | 320(HIV1) |
| CO72 | TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT | ||
| CO75(P) | GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA |
（二）PCR擴增步驟
1．擴增條件
當選擇的引物影響其特異性和擴增效果時，首先應考慮擴增的條件是否適宜。這些條件包括退火溫度，PCR循環(huán)數(shù)，反應物濃度等。擴增的條件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/ldNTP,每100μl反應體積2～4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,擴增25～30循環(huán),退火溫度為37℃,引物濃度6μg/ml。在37～55℃之間變更退火溫度可以找到提高產(chǎn)量和特異性的最佳溫度.盡管每個實驗室使用的擴增條件略有差異,但它們的原理都是相似的。
2.擴增的步驟
(1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA樣品。
(2)用10μl 1×PCR緩沖液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2,16mmol/LDTT)。
(3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。
(4)反應混合物于93℃變性處理7min。
(5)冷卻至室溫,加入4UTaqDNA聚合酶,反應最終體積為100μl。
(6)加入50μl礦物油,離心10s。
(7)置70℃保溫5min。
(8)PCR擴增25個循環(huán),95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。
PCR檢測出現(xiàn)假陰性的原因有：標本中的HIV-DNA量極少，未能有效地擴增或擴增產(chǎn)物達不到檢測水平；DNA模板和PCR產(chǎn)物未能完全變性，使得引物不能或較少與DNA片段結(jié)合，從而降低了最終產(chǎn)物的產(chǎn)量。如果臨床標本中的HIV基因發(fā)生變異，也會出現(xiàn)假陰性。PCR假陽性的原因主要有：標本的交叉污染；重復使用不干凈的器具。此外還要合理設置對照，陰性對照用無HIV-DNA標本的反應混合液，陽性對照用已知的HIV-DNA。
三、擴增產(chǎn)物的檢測和分析
擴增產(chǎn)物的檢測和分析可采用凝膠電泳，限制性內(nèi)切酶圖譜，DNA序列分析及分子雜交等技術(shù)。
（一）凝膠電泳分析
根據(jù)所采用的引物對之間DNA片段的長度，預計PCR產(chǎn)物的分子大小。通過與凝膠電泳后的DNA片段相比較，可初步判斷PCR產(chǎn)物的特異性，然后將產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶水解，進一步確定擴增產(chǎn)物的特異性。
（二）分子雜交分析
分子雜交既是檢測PCR產(chǎn)物特異性的一種較好的方法，也是檢測擴增產(chǎn)物的非限制性內(nèi)切酶位點上堿基突變的有效方法。分子雜交法是根據(jù)標記探針與兩條引物鏈之間特異DNA片段的互補性進行的。結(jié)果陽性說明PCR產(chǎn)物是特異性的。可利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針與PCR產(chǎn)物進行分子雜交，檢測PCR產(chǎn)物的堿基突變。現(xiàn)將檢測HIV-DNA的PCR擴增產(chǎn)物常用的幾種分子雜交技術(shù)分別介紹如下：
PCR擴增技術(shù)和分子雜交的敏感性。
PCR技術(shù)檢測HIV具有敏感性高，特異性強的優(yōu)點。該方法可檢測血液及組織標本中微量的HIV及前病毒序列。如對HIV-1感染H9細胞的擴增產(chǎn)物進行液相雜交和EB染色的電泳凝膠來檢測PCR技術(shù)的靈敏性。可檢測到0.05感染細胞的RNA量(相當于5個感染H9細胞的HIV-1-RNA/5×106個未感染細胞)。
四、PCR技術(shù)在HIV檢測中的應用
PCR可用來追蹤HIV的自然感染史。可在其它血清學和病毒學標志出現(xiàn)前檢測病毒序列，這樣可判定無癥狀而且血清陰性患者潛在的HIV的傳播性；可用來監(jiān)測長潛伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治療期間病毒的水平；也可用于HIV-1血清陽性母親的嬰兒的HIV檢測。在嬰兒出生后最初的6～9個月期間，他們的血液中存在母體的抗體，因此用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。
（一）血清抗體陽性病人HIV序列的檢測
有人從AIDS或ARC病人的外周血單核細胞培養(yǎng)物，精液細胞和精液上清制備DNA。然后用PCR法和逆轉(zhuǎn)錄酶測定法分別檢測HIV-1。PCR擴增產(chǎn)物與32P標記的探針退火之后用BstNI消化。再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和自顯影。結(jié)果表明，在逆轉(zhuǎn)錄酶陰性的28個細胞系中有9個以及用逆轉(zhuǎn)錄酶法不能確定的9個細胞系中有2個為陽性。這說明過去許多細胞培養(yǎng)物認為是陰性者，實際上用更敏感的PCR測定時則為陽性。
從血清陽性的HIV感染者的外周血單核細胞中可檢測出前病毒序列。通過共培養(yǎng)分離出病毒的血清陽性的同性戀男人血液制備的DNA，用PCR可100%檢出病毒序列；用血清陰性共培養(yǎng)陰性同性戀者的標本，經(jīng)PCR擴增檢出病毒序列者為64%，血清陰性正常人標本PCR檢測也為陰性，表明未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。由于HIV-1基因組的廣泛的異源性，為提高檢測的陽性率可采用多種引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法從313份已證實為抗體陽性的標本中檢測出310份HIV陽性（99%）。
(二)血清抗體陰性病人的HIV序列的檢測
由于在感染HIV后到出現(xiàn)免疫反應之前有一段滯后期,這個血清學陰性的滯后期通常長達6周至6個月,而且無抗體產(chǎn)生期可能更長些.在此期間受感染者往往檢測不到抗體,因此,血清陰性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中檢測到HIV-1比由血清學轉(zhuǎn)陽確診的時間可以提高6個月對少數(shù)初次共培養(yǎng)呈陰性的人,甚至可在血清轉(zhuǎn)陽之前24～39個月就能確診為HIV-1感染.對血清學試驗結(jié)果不能確定者,也可通過PCR作進一步分析和確診。
(三)新生兒HIV序列的檢測
HIV感染的母親其嬰兒由于母體抗體的存在,用抗體檢測法通常為陽性.但實際上只有20%～60%的嬰兒受到HIV感染.因此,對這些嬰兒進行HIV感染的早期診斷是十分重要的.現(xiàn)已證明30～50%的這些新生兒可在母親的子宮里,在分娩和引產(chǎn)或通過產(chǎn)后哺乳時從其母體感染HIV.新生兒血清陽性者并不能說明是HIV感染.因為母體HIV抗體可持續(xù)大約15個月久.在一般情況下,嬰兒并不表現(xiàn)出HIV感染的任何癥狀.病毒細胞培養(yǎng)法對嬰兒并不是一種可靠實用的方法;HIV特異IgM抗體的檢測在母體抗體存在下也是不可能的;在過量血清抗體存在下檢出血清中的HIV抗原也是十分困難的.另外,嬰幼兒被HIV感染后病情發(fā)展較快.早期診斷,對及時采取治療措施,延緩阻止病情發(fā)展極為重要.目前所使用的抗病毒藥毒性大,因而不能用于HIV抗體陽性而未感染的嬰幼兒.但當用PCR檢測出HIV-DNA序列后,即可進行抗病毒治療以及加強免疫機能和營養(yǎng)的治療.在一項研究中,14名血清陽性母親的新生兒用PCR檢測其中6個為陽性;在出生后12～15個月內(nèi)血清陰性的10個兒童中有5個為PCR陽性.從血清陽性母親出生1個月的新生兒中,收集的外周血單核細胞經(jīng)PCR檢測,7個為陽性的嬰兒,其中5個在檢測后10個月得AIDS;而PCR陰性的9個嬰兒,在16個月的追蹤檢查期間身體狀況良好.這些研究表明,PCR技術(shù)對被HIV感染母親的新生兒和血清陰性兒童進行早期的直接的HIV-1檢測是十分重要的.
PCR技術(shù)檢測HIV-DNA序列對AIDS和ARC的確診起著重要作用.但也有人認為對已知HIV抗體、抗原或培養(yǎng)陽性的病人不必再做PCR。最合適的PCR檢測對象是那些疑有HIV感染但又缺乏確切的血清學依據(jù)的人群，如上述的HIV陽性母親所生的嬰兒，陽性患者的性伴侶，靜脈吸毒者和可疑的血清反應者。PCR技術(shù)還可用來檢測血液制品及疫苗中有無HIV。
五、艾滋病診斷標準：
1．艾滋病病毒抗體陽性，又具有下述任何一項者，可為實驗確診艾滋病病人。
（1）近期內(nèi)（3-6個月）體重減輕10%以上，且持續(xù)發(fā)熱達38℃一個月以上；
（2）近期內(nèi)（3-6個月）體重減輕10%以上，且持續(xù)腹瀉（每日達3-5次）一個月以上。
（3）卡氏肺囊蟲肺炎（PCR）
（4）卡波濟肉瘤KS。
（5）明顯的霉菌或其他條件致病感染。
2．若抗體陽性者體重減輕、發(fā)熱、腹瀉癥狀接近上述第1項時，可為實驗確診艾滋病病人。
（1）CD4/CD8（輔助/抑制）淋巴細胞計數(shù)比值<1，CD4細胞計數(shù)下降；
（2）全身淋巴結(jié)腫大；
（3）明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)占位性病變的癥狀和體征，出現(xiàn)癡呆，辯別能力喪失，或運動神經(jīng)功能障礙。
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