醫學遺傳學/基因轉移方法

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醫學遺傳學基礎

基因治療
- 基因治療的方法
  - 基因轉移方法
  - 靶細胞

（1）特異正常基因的分離與克隆：應用重組DNA和分子克隆技術結合基因定位研究成果，已有不少基因并將會有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當代分子生物技術條件下，一般來說，只要有基因探針和準確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現在既可人工合成DNA 探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。

（2）外源基因的轉移：基因轉移（gene transfer）是將外源基因導入細胞內，其轉移方法較多，常用的要有下列幾類：

1）化學法：將正常基因DNA（及其拷貝）與帶電荷物質和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，直接傾入培養基中與細胞接觸，由于鈣離子有促進DNA透過細胞有作用，某些化合物可擾亂細胞膜，故可將DNA輸入細胞內，并整合于受體細胞的基因組中，在適當的條件下，整合基因得以表達，細胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細胞中只有一個細胞可結合導入的外源基因。要達到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細胞。當然，可以通過選擇培養的方法來提高轉化率。

2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。

①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電擊使細胞產生可逆性的穿孔，周圍基質中的DNA可滲進細胞，但有時也會使細胞受到嚴重損傷。

②顯微注射法：顯微注射（microinjection）是在顯微鏡直視下，向細胞核內直接注射外源基因，這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。此法用于生殖細胞時，有效率可達10％。直接用于體細胞卻很困難。在動物實驗中，應用這種方法將目的基因注入生殖細胞，使之表達而傳代，這樣的動物就稱為轉基因動物，目前成功使用得較多的是轉基因小鼠（transgenic mice），它可作為繁殖大量后代的疾病動物模型。

③脂質體法：脂質體（liposome）法是應用人工脂質體包裝外源基因，再與靶細胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達。

3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導入受體細胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培養基中生長，從而使未插入新基因片段的細胞死亡。對于體細胞基因治療，體外培養細胞的時間不能過長，篩選量大，故在臨床上應用也受限制難以進行。今后如能改進技術，提高重組率，這種定點修正基因的方法仍是有前景的。

4）病毒介導基因轉移：前述的化學和物理方法都是通過傳染方式基因轉移。病毒介導基因轉移（viral mediatedgene transfer）是通過轉換方式完成基因轉移，即以病毒為載體（vector）,將外源目的基因通過基因重組技術，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞，這種病毒稱為病毒運載體（viral vector）。目前應用的有兩種病毒介導基因轉移方法。

①反轉錄病毒載體：反轉錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉錄酶，可使RNA轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組。反轉錄病毒載體有以下的優點首先是具有穿透細胞的能力，可使近100％的受體細胞被感染，轉化細胞效率高；其次，它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的組織特異性；再者隨機整俁的病毒可長期存留，一般無害于細胞，但也存在缺點：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細胞，如神經元。最嚴重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細胞的功能，試圖避免上述缺點。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的病毒中的反轉錄酶可將RNA轉化為DNA，有助于該DNA順利進入宿主細胞的基因組，而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機的，所以還是可能激活細胞的原癌基因，以及因隨機插入發生插入突變。

在反轉錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工構建的結構如圖14-1。

②DNA病毒介導載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認為這類病毒難于改造成缺陷型病毒，實用意義不大，但

Mo-MLV結構示意圖

圖14-1 Mo-MLV結構示意圖

LTR：長末端重復序列，內含啟動子、增強子及有關調節順序；gag：病毒核心抗原基因；

env：病毒外殼蛋白基因；pol：反轉錄酶基因

牛乳頭瘤病毒重組后，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨立復制，并表達出基因產物。有人發現，因缺少E1區而致復制缺陷的腺病毒，可在表達E1基因的細胞中繁殖。后來證明，載有外源DNA的復制缺陷腺病毒呈現相同繁殖的特點。1993年法等國成功采用腺病毒載體進行心、腦、肺、肝內膽管和肌肉組織的體內基因轉移。它代表了基因治療的新方向。圖14-2是人的外源基因包裝在缺陷型反轉錄病毒中，感染細胞經培養后再輸入病人進行治療的模式圖。

人的外源基因包裝在缺陷型反轉錄病毒中感染細胞

圖14-2　人的外源基因包裝在缺陷型反轉錄病毒中感染細胞

經培養后再輸入病人體內進行治療模式圖

最近，美國設計了一個的腺病癥載體（圖14-3），它是用一個化學連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運輸器，通過一個表面抗體而進入細胞核，使宿主基因與治療基因共同表達。這個新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）。

腺病毒賴氨酸DNA復合體

圖14-3 腺病毒賴氨酸DNA復合體

采用復制缺陷的腺病毒進行基因治療有以下優點：①該病毒可感染分裂和非分裂的細胞，并能得到大量基因產物，對神經細胞、心肌細胞等基因缺陷的糾正有特殊意義；②病毒顆粒相對穩定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低；③可有效轉導多種靶細胞后而少游離于細胞基因組外，并持續表達；④已用于基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。前述的新腺病毒載體還有一大優點是可以成功地運載48000bp的基因，而其它病毒只能運輸70 00bp的基因。這些優點顯示了腺病毒介導載體的廣闊應用前景。