雙向電泳
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雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）
是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大小），經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離. 目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質. 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加］. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失］. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰. 亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標準)、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點. 由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生0～10%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性.
2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match). 對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎. 第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte, CA)，在管膠內建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失. 因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題. IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性. 目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性. 目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術. 銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質檢測. 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.
較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術.
常見問題及其解答重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？ 一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？ 這是因為 BioRad 的電泳槽有個蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個蓋子上設計了對應的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個突起會導引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個現象的發生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。 跑第一向時，為什么要設定一個電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)？ 電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，從而對等電聚焦產生影響。 跑第一向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？ 剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由于這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區域移動。 跑第一向時，為什么會產生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？ 藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區時（ pH4 ），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質大分子聚焦之前。 跑第一向時，為什么電壓總達不到預定值？ 當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。 跑第一向時，在電壓達到預定值后，電流為什么會降低？ 當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。 跑第一向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產生？ 等電聚焦完成后，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。 重泡脹緩沖液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？ 硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。 怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？ 可以用 BioRad 生產的 2D 膠標準蛋白來校準。也可以用體系內已知蛋白來做比對。 為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？ 橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不完全； 2 ）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因為跑二向時，蛋白的溶解度不好。 什么成分會影響 2D 膠的效果？ 核酸，鹽，去垢劑等等。 2D 膠的上樣量應該在什么范圍？ 上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。 我的蛋白質濃度很低，應該用什么方法來濃縮？ 蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。 透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較干凈的環境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。
附：雙向電泳完整的操作步驟
（一）第一向等電聚焦
1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。
6. 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。
7. 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
9. 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
10.聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE電泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水（沒有milliq的話ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。
4. 配制膠條平衡緩沖液I。
5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
6. 將膠條轉移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配制膠條平衡緩沖液II。
8. 第一次衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
12.第二次衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
16.放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
19.電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。
20.進行染色。
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