單克隆抗體技術(shù)
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單克隆抗體技術(shù)(monoclonal antibody technology)，20世紀(jì)后期免疫學(xué)技術(shù)的重大突破，應(yīng)用B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體(McAb)。 B細(xì)胞雜交瘤是免疫的小鼠脾細(xì)胞 （B淋巴細(xì)胞）與小鼠骨髓瘤（一種漿細(xì)胞瘤，漿細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞系的終末形式）細(xì)胞融合而成的雜交細(xì)胞，其核內(nèi)含有雙親細(xì)胞的染色體，繼承了親代細(xì)胞的特征，它既具有瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)中迅速增殖的能力，又具備免疫脾細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的特性。B細(xì)胞雜交瘤經(jīng)過(guò)單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可繁殖成為一個(gè)細(xì)胞系（稱(chēng)為克隆或克隆系），這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為克隆化，而由一個(gè)克隆系產(chǎn)生的抗體稱(chēng)單克隆抗體。這種抗體只能特異地與抗原分子上的一個(gè)抗原決定簇結(jié)合反應(yīng)，抗體成分均一，抗體的結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，且在培養(yǎng)過(guò)程中只要不發(fā)生變異，不同時(shí)間內(nèi)分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)和功能。因此，用這種技術(shù)可按人們的意愿生產(chǎn)大量很純的單克隆抗體，這些都是用普通血清學(xué)方法所不能達(dá)到的。這技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，并為臨床疾病的診斷、治療提供了新手段。帶有多個(gè)抗原決定簇的抗原分子注入動(dòng)物體內(nèi)，被帶有相應(yīng)抗原決定簇受體的淋巴細(xì)胞所識(shí)別，它們活化、增殖，每一個(gè) B細(xì)胞系分別分泌針對(duì)單個(gè)抗原決定簇的抗體分子。普通抗血清是含有這些抗體的混合物。而將免疫小鼠的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)克隆化，所產(chǎn)生的抗體是高度純一的單克隆抗體。
目錄 |
B細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)
先將免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞在融合劑的作用下融合。融合后加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞及次黃嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶核苷(HAT)的選擇培基中篩選雜交瘤，測(cè)定抗體活性，進(jìn)行克隆化，篩選出能產(chǎn)生所需特異性和性質(zhì)的抗體的亞克隆，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)或接種于同系小鼠的腹腔中，使其在動(dòng)物體內(nèi)增殖，從而能獲得大量的單克隆抗體。
骨髓瘤細(xì)胞系的選擇與培養(yǎng)
目前常用的適于融合的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB/C小鼠和 Lou系大鼠。小鼠骨髓瘤細(xì)胞早期是采用缺少 HGPRT或TK酶但可分泌免疫球蛋白(無(wú)抗體活性)的骨髓瘤細(xì)胞 X63-Ag8細(xì)胞株。用X63-Ag8與免疫脾細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，具有能合成兩個(gè)親代免疫球蛋白重鏈和輕鏈的基因，因而產(chǎn)生特異性抗體機(jī)率低。現(xiàn)多采用完全不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞株 （稱(chēng)為不產(chǎn)生者）， 如SP2/O-Ag14、X63-Ag8.653 、FO等細(xì)胞系，這樣使雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白只含有免疫脾細(xì)胞的重鏈和輕鏈，從而大大提高了所產(chǎn)生特異性抗體的比率。
骨髓瘤細(xì)胞系長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)，可能會(huì)產(chǎn)生抗 HAT的變種，即由缺陷HGPRT回復(fù)至能產(chǎn)生HGPRT的突變株，以致融合率下降。因此每隔3～6個(gè)月將骨髓瘤細(xì)胞置于含8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以除去回復(fù)突變的細(xì)胞。必要時(shí)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行再克隆，選擇質(zhì)量好的骨髓瘤亞克隆，并深凍一大批以供使用。用于融合的骨髓瘤細(xì)胞必須處于活躍的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。每隔2～3天應(yīng)換新的培養(yǎng)液繼續(xù)傳代一次，可以使用于融合的骨髓瘤細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期一周左右，細(xì)胞存活率在90～95％。
免疫的小鼠脾細(xì)胞
由于供融合的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)自BALB/C小鼠，故多選用同系BALB/C小鼠進(jìn)行免疫。以8～12周齡雌性鼠為宜。大鼠可產(chǎn)生大量抗體，融合時(shí)亦可選用大鼠作為免疫脾細(xì)胞的供體。經(jīng)特定抗原的免疫，小鼠脾臟中分泌特異性抗體的B細(xì)胞數(shù)量增加并分化、增殖為漿母細(xì)胞，這些細(xì)胞易與骨髓瘤細(xì)胞融合。
免疫程序與方法各實(shí)驗(yàn)室不同，主要依抗原的性質(zhì)及動(dòng)物對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)的不同來(lái)設(shè)計(jì)免疫方案。一般說(shuō)，可溶化蛋白抗原的免疫原性弱，而應(yīng)用佐劑加強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。初次免疫時(shí)將抗原與等量弗羅因德氏完全佐劑混合，腹腔或皮下注射。2～4周后以同量抗原加等量不完全弗羅因德氏佑劑腹腔注射。再過(guò)2～6周，在融合前3～4天，腹腔或靜脈注射不加佐劑的抗原作為加強(qiáng)免疫。完整的細(xì)胞免疫原性強(qiáng)，不需應(yīng)用佐劑。由于動(dòng)物對(duì)抗原的免疫反應(yīng)可能有個(gè)體差異，最好一次免疫3～5只小鼠，選擇免疫反應(yīng)好的小鼠，取混合脾進(jìn)行融合，亦可分別取一個(gè)小鼠的脾臟分別進(jìn)行3～5個(gè)融合。
融合的骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的比例可以是1:1～1:10。但若脾細(xì)胞濃度過(guò)高，融合后多數(shù)培養(yǎng)孔中有多個(gè)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，使克隆化難以進(jìn)行。一般在微量的多孔培養(yǎng)板中，每孔加入的融合后細(xì)胞總數(shù)以2×105個(gè)為宜，但最高細(xì)胞密度不得超過(guò)106個(gè)/孔。
融合劑
兩種細(xì)胞間的自發(fā)性融合率很低，一般為10-6～10-7。 細(xì)胞融合劑聚乙二醇(PEG)可促進(jìn)細(xì)胞融合。作用機(jī)理可能為使脂膜易于打開(kāi)，通常用分子量1000～4000的50％PEG溶液， 在37℃和pH8～8.2，作用1～2分鐘效果最佳。有人認(rèn)為PEG中加二甲亞砜作為融合劑，效果更好。
HAT選擇雜交瘤細(xì)胞
據(jù)報(bào)道用108個(gè)脾細(xì)胞與5×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG作用融合后，能存活下來(lái)，形成穩(wěn)定雜交瘤的細(xì)胞數(shù)只不過(guò)100～200個(gè)，即以脾細(xì)胞計(jì)算為1/100萬(wàn)或1/50萬(wàn)，這樣培養(yǎng)物中未融合的骨髓瘤細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，將會(huì)干擾雜交瘤細(xì)胞的生存。為清除未融合的骨髓瘤細(xì)胞并且篩選出雜交瘤細(xì)胞，現(xiàn)普遍應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)基， 其中含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷。在 HAT培基中小鼠骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞死亡，而雜交瘤細(xì)胞繁殖形成克隆。骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)缺乏次黃嘌呤－鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，不能利用培基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷，所以未融合的骨髓瘤細(xì)胞不能繁殖。而小鼠脾細(xì)胞雖有HGPRT和TK，但缺乏在組織培基中繁殖的能力，一般在兩周內(nèi)死亡。唯有骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，可以從小鼠脾細(xì)胞中獲得HGPRT和(或)TK，在HAT培養(yǎng)基中可通過(guò)核酸代謝旁路將次黃嘌呤合成嘌呤核苷酸和(或)將胸腺嘧啶核苷合成嘧啶核苷酸，進(jìn)而合成DNA。因此雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中繁殖成克隆。
飼養(yǎng)細(xì)胞
細(xì)胞溶合后，用 HAT培基選擇雜交瘤細(xì)胞時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞大量死亡，單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞在低密度時(shí)不易存活，必需加入其他活細(xì)胞才能使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞叫做“飼養(yǎng)細(xì)胞”。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞、小鼠或大鼠胸腺細(xì)胞、大鼠胚胎傳代纖維母細(xì)胞或經(jīng)過(guò)γ射線照射的人胚肺纖維母細(xì)胞等。通常多采用腹腔巨噬細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞可與融合細(xì)胞同時(shí)加到培養(yǎng)孔中，或提前一天加到培養(yǎng)孔中，由不同品系小鼠或異種鼠取得的腹腔巨噬細(xì)胞均同樣有效。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在效能上有差異，最好每次融合也用2～3個(gè)以上的小鼠腹腔混合液。
陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選
細(xì)胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5～14天，即可在培養(yǎng)板孔中生長(zhǎng)出雜交瘤細(xì)胞集落，此時(shí)便可測(cè)定抗體活性，對(duì)能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)及早進(jìn)行克隆化，以防因不產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)而丟失。另外，開(kāi)始測(cè)定時(shí)由于分泌抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞數(shù)尚少，可能測(cè)得抗體陰性，因此應(yīng)重復(fù)測(cè)定抗體活性2～3次，并在換液后3～4天進(jìn)行，以便抗體積累。為盡早篩選出分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，需要用敏感、可靠、快速的方法測(cè)定，常用的有固相放射免疫測(cè)定法（RIA），酶免疫分析法(EIA)和免疫熒光法(IFA)等來(lái)檢測(cè)上清中的微量抗體。
①固相放射免疫測(cè)定法：原理是抗原結(jié)合到固相載體的表面，并保持其免疫活性。若待測(cè)標(biāo)本中存在對(duì)此抗原的特異性抗體，就會(huì)同吸附在載體表面的抗原結(jié)合，然后與放射性核素125Ⅰ標(biāo)記的第二抗體一起孵溫育，即可根據(jù)放射性強(qiáng)度，判讀有無(wú)相應(yīng)抗體的存在。本法敏感、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，是目前篩選雜交瘤抗體最常用的方法。②酶免疫分析法:常用的是間接法，原理是用酶標(biāo)記的第二抗體篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清中與抗原結(jié)合的抗體。此法的靈敏度和特異性與放射免疫測(cè)定法相似，但更簡(jiǎn)便、快速，顯色反應(yīng)可用肉眼鑒別，且酶標(biāo)試劑比較穩(wěn)定，是常用于初篩的方法。其缺點(diǎn)是某些細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)源酶（如過(guò)氧化物酶），造成陰性對(duì)照本底較高，影響結(jié)果的判讀。此外，用該法不易查到對(duì)一小群細(xì)胞（細(xì)胞亞群）起反應(yīng)的抗體，此時(shí)可能將這種弱反映誤認(rèn)為本底而漏掉。③免疫熒光法：采用熒光色素標(biāo)記第二抗體，用間接免疫熒光染色法檢測(cè)活細(xì)胞膜表面抗原的抗體。本法已廣泛用于雜交瘤上清的篩選，能敏感地檢出抗細(xì)胞亞群表面抗原的抗體。免疫熒光法的全過(guò)程可在96孔聚乙烯微量板中進(jìn)行，結(jié)合運(yùn)用熒光激活細(xì)胞分類(lèi)儀(FACS)分離熒光染色陽(yáng)性和熒光染色陰性的細(xì)胞。本法是大量、快速篩選分泌抗體的雜交瘤的有效方法，但因價(jià)格昂貴而不易推廣。
雜交瘤細(xì)胞的克隆化
對(duì)陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，是獲得純的克隆系的一個(gè)重要步驟。克隆化時(shí)應(yīng)注意：①融合后，一旦抗體檢測(cè)陽(yáng)性，應(yīng)立即進(jìn)行克隆化，同時(shí)雙份傳代，液氮凍存。②融合后，待骨髓瘤細(xì)胞確已死亡，可將 HAT培養(yǎng)液換以HT培養(yǎng)液，初次克隆化時(shí)加HT。③應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行克隆化時(shí)必須經(jīng)過(guò)多次克隆（至少兩次以上），才能基本保證雜交瘤細(xì)胞為單克隆。④克隆化后的雜交瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中有時(shí)也會(huì)發(fā)生變異或染色體丟失，失去產(chǎn)生特異性抗體的能力，因此需定期測(cè)定培養(yǎng)上清中抗體的滴度。若抗體滴度下降或轉(zhuǎn)陰性時(shí)，則應(yīng)復(fù)蘇原始凍存的細(xì)胞管，進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)，必要時(shí)應(yīng)再克隆化和再凍存。
克隆化的方法為:①有限稀釋法。本法簡(jiǎn)便易行，不需特殊設(shè)備，克隆效應(yīng)高，故最常用。方法是將測(cè)得抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞作連續(xù)稀釋，稀釋至每毫升含10個(gè)細(xì)胞或更少，按定量分種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔培養(yǎng)板中，直接觀察孔里是否僅有一個(gè)細(xì)胞集落生長(zhǎng)。在初次克隆化時(shí)，有的生長(zhǎng)孔中只有一小部分有抗體活性，故應(yīng)將陽(yáng)性克隆細(xì)胞移至24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存一部分細(xì)胞，及時(shí)進(jìn)行再克隆，以提高抗體陽(yáng)性克隆的百分率和保證雜交瘤細(xì)胞的單克隆化。②軟瓊脂培養(yǎng)法。將適當(dāng)濃度的雜交瘤細(xì)胞加至軟瓊脂培養(yǎng)基中，使由一個(gè)細(xì)胞增殖的克隆形成一個(gè)集落，將細(xì)胞集落擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，測(cè)定上清液的抗體活力，若為陽(yáng)性就可選出所需抗體的克隆。本法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞融合后可直接進(jìn)行克隆化，其缺點(diǎn)是克隆陽(yáng)性率低，克隆化所需細(xì)胞濃度較高，因此所得單個(gè)細(xì)胞集落并不能絕對(duì)代表單個(gè)細(xì)胞克隆，常需進(jìn)行再克隆化。
雜交瘤細(xì)胞的增殖
一旦雜交瘤細(xì)胞成功地克隆化，就可進(jìn)行大量增殖以產(chǎn)生抗體。其方法有：①體外擴(kuò)大培養(yǎng)法。剛獲得的雜交瘤細(xì)胞系不能耐受稀釋?zhuān)虼伺囵B(yǎng)物應(yīng)逐漸擴(kuò)大。先將96孔培養(yǎng)板中抗體陽(yáng)性的細(xì)胞作1:3或1:5稀釋?zhuān)浦?4孔培養(yǎng)板中孵育，再將其中抗體陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)大到25cm2培養(yǎng)瓶，然后轉(zhuǎn)種至75cm2的大培養(yǎng)瓶中大量增殖，一般細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體含量可達(dá)5～50μg/ml。②動(dòng)物接種。將雜交瘤細(xì)胞接種于同系小鼠皮下或腹腔內(nèi)，約10天后，分別自血清或腹水中獲取較大量的抗體。
雜交瘤細(xì)胞的保存與復(fù)蘇
在雜交瘤培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)盡早地將抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞凍存起來(lái)，放入液氮中(-196℃)保存，以防因體外傳代培養(yǎng)的細(xì)胞突變或因污染而丟失。
細(xì)胞復(fù)蘇的方法是：從液氮中取出細(xì)胞管，立即放在37℃水浴中化凍，并立即用毛細(xì)吸管吸出細(xì)胞。放入培養(yǎng)液中離心，將沉淀的細(xì)胞懸于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
單克隆抗體的提純
單克隆抗體的保存
由腹水中獲得的抗體，經(jīng)離心去除細(xì)胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心，取上清液加0.1％NaN3，少量分裝，冷凍于-70℃可保存幾年。 但應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體，冷凍干燥保存于2～8℃，取出時(shí)溶解后，保存于2～8℃，至少一個(gè)月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4℃)保存兩年，融化后放置4℃下保存一個(gè)月。短期使用的腹水抗體，4℃3～4 個(gè)月仍保持穩(wěn)定， 培養(yǎng)上清加0.1％NaN3，貯于-20℃，兩年不失活性。
單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用
單克隆抗體用于臨床診斷和治療，目前研究較多的是抗人 T細(xì)胞單克隆抗體，用以識(shí)別人T細(xì)胞表面的不同抗原決定簇，有OKT系統(tǒng)及Leu系統(tǒng)。T細(xì)胞，特別是免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Ti/h及Tc/s細(xì)胞）對(duì)于調(diào)控免疫應(yīng)答和維持免疫自穩(wěn)起著至關(guān)重要的作用，臨床上許多疾病的發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)失常有關(guān)，因此，研究 T細(xì)胞在這些疾病中的變化，有助于探討病因和輔助診斷。各種免疫缺損病、腫瘤或感染性疾病都與免疫功能低下有關(guān)，而變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病等與免疫功能亢進(jìn)有關(guān)。因此應(yīng)用 OKT系列單克隆抗體檢測(cè)這些疾病患者外周血中T細(xì)胞亞群及T4/T8比值的變化，對(duì)探討發(fā)病機(jī)理，及時(shí)診斷疾病及監(jiān)測(cè)病情發(fā)展有十分重要的意義。接受腎移植或骨髓移植的患者往往需應(yīng)用各種免疫抑制劑以控制排斥反應(yīng)， T細(xì)胞亞群的檢測(cè)有助于了解移植器官的排異和發(fā)展。
抗人 T細(xì)胞單克隆抗體可用以治療白血病、移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)和急性腎排斥等，目前尚處于摸索階段。
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