臨床生物化學/血漿蛋白質的檢測及其臨床應用

跳轉到：導航, 搜索

臨床生物化學

蛋白質與臨床診斷
- 健康與疾病時的血漿蛋白質
  - 血漿蛋白質的理化性質、功能與臨床意義
  - 關于血漿蛋白質的正常參考值
  - 疾病時血漿蛋白質變化的圖譜特征
  - 血漿蛋白質的檢測及其臨床應用

血漿蛋白質的檢測及其臨床應用可以概括為以下幾方面：

2．通過電泳將血漿（或血清）蛋白質初步分離，可以半定量地檢測主要蛋白質的組分及其圖譜，如Alb、α₁、α₂、β₁、β₂、γ等區帶，并以相對百分比表示之。

3 ．特異的定量測定個別蛋白質，多采用免疫化學的技術，通過制備特異的抗血清（或抗體）測定抗原-抗體復合物。依據抗原抗體結合及其復合物的檢測手段可有濁度亮度法、沉淀法、免疫擴散法、免疫電泳法等。如果含量很微的蛋白質則采用放射免疫測定法（RIA）及酶免疫測定法（EIA）。

此處僅從臨床的需要，對方法學的臨床應用及其進展作一簡介。

（一）血清總蛋白質的測定

新鮮全血采取后經自然凝固，析出血清，除去含量約為2-4μg/L的纖維蛋白原，剩下的即為血清蛋白質。健康成人在活動狀態采血，其含量為63-83g/L，平臥休息時為60-78g/L。血漿總蛋白質含量的變化不外兩大原因；一是血容量的改變（濃縮或稀釋）；二是個別蛋白質組分的明顯增加或減少。血濃縮時的高血漿蛋白血癥，各個組分成比例的增加（病史中有失水史）。血稀釋時的低血漿蛋白血癥亦是相對的，各組分蛋白質仍保持正常的比例。

由于個別蛋白質的變化所致的低蛋白血癥，最多見的原因是低血漿白蛋白。輕度的高蛋白血癥可由于慢性感染性疾病引起的多克隆，彌散性的γ球蛋白增多癥是由于多發性骨髓瘤或異常蛋白血癥時單克隆免疫球蛋白增多。

應當指出，在進行化學定量測定血漿蛋白質時，我們作了如下假定：①所有血漿蛋白是純的多肽鏈（糖脂類和金屬有機物等均不計在內），其含氮量平均為16%；②幾百種血漿蛋白其理化性質雖不同，但與化學試劑作用產生的反應（如呈色、沉淀）是一致的。顯然，這是過于理想化了的，事實上前一種情況是不存在的，后一種情況在不同蛋白質之間也有很大的差別，因此采用任何一種化學方法作血漿蛋白質的測定，嚴格來講都是從實用出發的，是相對的定量。

至今，凱氏定氮法仍然是建立各個具體方法時采用的參考標準方法。

雙縮脲比色法是目前首先推薦的蛋白質定量方法。方法操作簡便，雖然雙縮脲試劑有大同不異。其中酒石酸鉀納可以穩定在堿性溶液中的銅離子，含有碘化物作為抗氧化劑。雙縮脲反應生成的復合物其吸收峰為540nm。可采用公認的標準牛血清白蛋白作為標準品，經精確稱量，必要時用凱氏定氮法標定。各地質控中心提供的混合標準血清可作為第二參考，血清用量100μl，在10-120g/L濃度范圍內呈良好線性關系，批內CV值<2%，其它常用的方法還有：

1．基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法由于各種蛋白質分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達2%-3%，導致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu²⁺，集中原法和雙縮脲反應兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴于Cu²⁺。反應產物最佳吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利于檢測較微量的蛋白質。但試劑反應仍易受多種化合物的干擾。

2．采用280nm和215/225紫外吸收值，計算蛋白質含量　280nm 是由于蛋白質分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和準確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質的影響。

3．采用沉淀反應進行散射比濁法　用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡便，不需特殊儀器，技術關鍵在于：①選擇最佳試劑濃度及溫度；②混勻技術；③選用的標準；④待測標本中的蛋白濃度。

4．染料結合法蛋白質可與某些染料特異結合，如氨基黑（amino black）與考馬亮藍（comassive brilliant blue ）。這一性質除了可以用于電泳后的蛋白質區帶染色，亦可用于總蛋白質的定量。缺點是多種蛋白質與染料的結合力不一致。考馬亮藍在與蛋白質結合后的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質可用分光光度法來定量檢測。

關于用化學方法測定白蛋白，現多采用特異性的染料（BCG或BCP）結合法，已于第一節中介紹。

（二）血清蛋白質的電泳分析

醋酸纖維薄膜（ACM）和瓊脂糖凝膠是目前最廣泛采用的兩類介質。巴比妥緩沖液pH8.6，離子強度0.05，標本用量3-5μl，標準電泳條件為CAM每厘米寬電流0.75mA，瓊脂糖約為每厘米寬10mA，電泳時間40-60分鐘，電泳前沿達6cm左右。雖然目前已開展和應用不少個別蛋白質的測定方法，但血漿蛋白質電泳圖譜至今仍然是了解血漿蛋白質全貌的有價值的方法，可用為初篩試驗，以提供較全面的信息。正常血清電泳后可以很好地分為5條區帶（Alb、α₁、α₂、β₁、β₂），新鮮標本可以分出β帶（以C₃成分為主）。由于各條區帶中各個蛋白質組分的重疊、覆蓋（如CER常被α₂MG及Hp所掩蓋），以及某些蛋白質染色帶很淺（如脂蛋白和α₁糖蛋白），可以用其它染色方法輔助。目前除了常使用的氨基黑和麗春紅染料外，還采用靈敏度更高的考馬亮藍。

用血清蛋白質電泳測定各組分的含量，通常可采用各區帶的濃度百分比（%）或絕對濃度（g/L）表示之。

用醋酸纖維薄膜電泳測得正常小兒及成人血清蛋白質的參考值可參見表2-7。

在疾病情況下血清蛋白質可以出現多種變化。根據它們在血清蛋白質電泳圖譜上的異常特征，不少學者曾試將其分為以下類型，參見表2-8及圖2-1。

表2-7 各年齡組血清蛋白質電泳正常值（X±SD）范圍

年齡	總蛋白質（g/L）	蛋白質各組分的濃度比（%）
白蛋白	總蛋白質（g/L）	α₁	α₂	β	γ
臍帶血	57	69.4	2.5	5.4	7.0	15.4
	±12	±5.6	±1.0	±1.6	±2.4	±4.4
新生兒	60	64．2	3．5	14．1	9．2	6．2
	±12	±13.2	±3.6	±2.1	±2.4	±4.8
1-5歲	68	65.2	3.1	11.2	10.2	10.4
	±11	±7.8	±1.3	±2.7	±2.6	±5.5
6-12歲	69	61.7	3.0	10.5	10.2	14.7
	±14	±6.1	±1.8	±3.4	±2.0	±5.8
成人^△1		64	2.8	6.6	7.2	14.4
		45-78	0.8-6.2	3.4-12	4.8-14	7.0-25
2		64	2.8	5.9	9.8	17.5
		55-71	0.9-4.8	2.6-9.2	6.3-13.3	12.2-22.3
3		68.7	3.1	6.0	8.2	13.8
		53-76.6	1.3-5.0	2.7-9.9	5.5-14.9	8.8-21.3
4		62.2	4.2	6.6	10.2	17.33
		47-77	0.7-7.6	2.4-10.8	4-16.4	8.8-25.7
5		65.7	2.28	5.7	8.8	17.5
		58.8-72.7	0.7-3.8	3.6-7.8	6.3-11.3	12.3-22.7

△資料取自不同作者：①上海醫科大學n=50；②重慶醫科大學n=123；③同濟醫科大學n=132；④蘇州醫學院n=100；⑤湖南醫科大學n=100

表2-8　異常血清蛋白質電泳圖譜的分型及其特征

血清蛋白質的圖譜類型	總蛋白質	Alb	α₁	α₂		β		γ
1.低蛋白血癥	↓↓	↓↓	N↑	N		↓		N↑
2.腎病型	↓↓	↓↓	↑	↑↑				不定
3.肝硬化型	↓N↑	↓↓	N↓	N↓				β-γ↑（融合）
4．急性炎癥或急性時相反應癥	N	↓N	↑	↑				N
5.慢性炎癥型		↓	↑	↑				↑
6.彌漫性肝損害型	↓N	↓↓	↑↓					↑
7．彌漫寬γ球蛋白血癥型	↑	↓N						↑↑
8.M蛋白血癥型		在α-γ區帶中出現M蛋白峰-M區帶峰
9．高α₂（β）-球蛋白血癥		↓			↑↑		↑
10.妊娠型（高α型）	↓N	↓	↑				↑	N
11.蛋白質缺陷型		個別區帶出現特征性缺乏

上述電泳圖譜分型有助于臨床疾病判斷的參考。在某些蛋白質異常增多的情況下，可出現異常區帶。如高濃度的αFP可以在Alb與α₁區帶間出現一條清晰的新帶（有人稱之為肝癌型）；CRP異常增高可出現特殊界限的γ區帶；單核細胞白血病可出現由于溶菌酶異常增多的γ后區帶等；單克隆免疫球蛋白異常癥（M蛋白血癥）則在α-γ區帶中出現一條很深的界限截然的M區帶。

在大劑量使用青霉素或水楊酸等藥物時，由于藥物與白蛋白的結合，可導致這部分白蛋白電泳遷移率的加快而出現區帶狀的改變。

急性時相反應型常以α₁及α₂區帶加深為特征；妊娠型以α₁區帶增高為特征，伴有β區帶的增高；以α₂區帶增高為特征的圖譜常見于風濕病等免疫反應性疾病。其它慢性炎癥則同時有α₁、α₂及γ-球蛋白的增加。在肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化可以出現β、γ區帶融合彌散的寬γ帶。慢性遷延型肝炎、慢性活動型肝炎及慢性反復感染可以出現多條γ區帶的加深。

（三）免疫化學法測定個別蛋白質

散射比濁法和透射比濁法由于測定方法簡便、快速而被廣泛使用。許多試劑盒供應抗血清及標準蛋白質，即可建立此測定法。此技術可以測定抗原-抗體復合物（沉淀顆粒）形成的量（終點法），亦可采用測定復合物形成的速率（動力學方法，即通過散射濁度計測定抗原-抗體混合反應復合物顆粒形成的時間，即反應速率。一定條件下，反應速率與反應體系中抗原的含量直線相關，可以通過制備標準曲線而計算）。

現已有設計完善的帶微電腦進行數據處理的散射濁度計和透射濁度計，以免疫化學系統（immuno-chemicalsystem,ICs ）可供應。免疫擴散法不需昂貴設備，放射免疫法則需要液體閃爍計數器及應用放射性同位素。

現將幾種常用的免疫化學測定法的特點列表總結比較于表2-9、10中。

表2-9　電泳與免疫化學檢測血清蛋白列表比較

電泳法（CAM法）	各種免疫化學分析法
前白蛋白	前白蛋白
白蛋白	白蛋白
α₁球蛋白（區帶）	α₁抗胰蛋白酶
	α₁酸性糖蛋白
	α₁脂球蛋白
	α₁脂蛋白
	甲狀腺激素結合球蛋白，皮質醇結合蛋白
α₂球蛋白（區帶）	結合珠蛋白
	α₂巨球蛋白
	銅藍蛋白
	前β脂蛋白
β球蛋白（區帶）	轉鐵蛋白
	血紅素結合蛋白
	補體C_-4，C₃
	β₂微球蛋白
γ球蛋白（區帶）	IgG，A，M，D，E
	C反應球蛋白

表2-10　幾種免疫化學測定方法的比較

靈敏度	準確性	檢測時間
散射比濁法　10mg/L	批內CV值<5%	幾分鐘（動力學法）
		1小時　（終點法）
透射比濁法　20-30mg/L	批內CV值5%-10%	1小時內
免疫擴散法　>20mg/L	批間CV值5%-15%	1-2天
放射免疫法 μg/L	批內CV值5%-10%	幾小時

關于免疫化學測定方法中的標準品和方法的標準化問題：含有準確含量的純抗原蛋白不易買到。制備的抗血清由于其來源不同，其特異性和靈敏度效價有很大差異，一個純蛋白制劑來制備高特異性的抗血清亦非輕易之舉。因此抗血清的制備和方法的標準化是方法推廣和使用的關鍵。據美國病理學會的研究報告，測α₁AT用同一標本，使用5種不同的方法在510個實驗室報告的結果從1.6-2.34g/L。同一研究中C₃補體的測定采用了8種不同方法，測定結果為149-282mg/L。

世界衛生組織目前提供以下參考標準品：IgG 、IgA、IgM、IgD、IgE、αFP、CEA、Alb、C₃、CER及TRP。使用國際單位（IU），沒有使用絕對的質量單位。美國疾病控制中心（CDC）供應的國家參考標準品人血清蛋白質含13種蛋白質，亦使用WHO的國際單位標明含量。

由于不易獲得穩定的抗血清和標準化的參考蛋白質，各個實驗室還不得不根據自己的條件建立自己的正常參考值。