臨床生物化學(xué)/方法建立時(shí)的條件選擇
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在方法建立的原理確定后，尚需根據(jù)其原理來(lái)選擇合適的條件，以保證所建的方法可靠。下面以亮度法為例介紹其條件選擇的主要環(huán)節(jié)。顏色反應(yīng)是亮度分析的基礎(chǔ)，因此，用作亮度測(cè)定的顏色反應(yīng)至少要具備以下幾條：反應(yīng)有較高的特異性，從而干擾小；反應(yīng)產(chǎn)生的有色物質(zhì)吸光系數(shù)要大，大者靈敏度高；有色產(chǎn)物的離解度要小，小則穩(wěn)定；此外，還要求有色產(chǎn)物有恒定的組成成分，使產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定。由于影響顏色反應(yīng)的因素很多，如溫度、pH、試劑濃度、反應(yīng)的時(shí)間等等。這些因素在建立新方法時(shí)都要逐項(xiàng)試驗(yàn)，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。
（一）選擇合適的吸收光譜
實(shí)際上就是測(cè)定顏色反應(yīng)產(chǎn)生的光吸收曲線(xiàn)。方法是在整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波長(zhǎng)范圍還應(yīng)再細(xì)分）間隔。分為十幾個(gè)點(diǎn)測(cè)定其在不同波長(zhǎng)時(shí)的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)繪成光吸收曲線(xiàn)。在條件許可的情況下，應(yīng)采用雙光束分光光度計(jì)在可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果較為可靠。同時(shí)，還應(yīng)以同法分別測(cè)定其空白液和標(biāo)準(zhǔn)物顏色產(chǎn)物的吸收曲線(xiàn)。測(cè)定光吸收曲線(xiàn)的目的是找出最大吸收波長(zhǎng)，作為光度法波長(zhǎng)選擇的依據(jù)。因?yàn)樵谧畲笪詹ㄩL(zhǎng)測(cè)定，可獲得最大靈敏度，且能更符合比耳定律。然而在實(shí)際使用中，不能單純考慮靈敏度高，還要考慮在測(cè)定濃度范圍能否符合比耳定律，并能在光度計(jì)準(zhǔn)確區(qū)域內(nèi)（吸光度0.2-0.85之間）讀出讀數(shù)。有時(shí)由于測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)并不是所要測(cè)定物質(zhì)的特性吸收波長(zhǎng)，即同時(shí)存在具有相似最大吸收的干擾物質(zhì)，為了保證實(shí)驗(yàn)的特異性，常改用特有而非最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。例如用磷鉬酸測(cè)定血糖，選用波長(zhǎng)420nm，溶液對(duì)此波長(zhǎng)的吸收比其它波長(zhǎng)光線(xiàn)的吸收都低，其目的是使參考值有一個(gè)較低的吸收，這樣可允許在相同情況下對(duì)高出參考值的血糖也能得到準(zhǔn)確的讀數(shù)。因?yàn)樵谶@項(xiàng)測(cè)定中，高血糖是常見(jiàn)的變化方向。
（二）測(cè)定方法適用的濃度范圍
根據(jù)光吸收定律，溶液的吸光度應(yīng)與溶液的濃度成正比。但由于有色物質(zhì)的電離、水解、締合等原因當(dāng)溶液稀釋或增濃時(shí)，有色物質(zhì)顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。測(cè)定方法適用的濃度范圍是指分析的濃度范圍在直線(xiàn)線(xiàn)性段，濃度與吸光度之比為一常數(shù)，此時(shí)直線(xiàn)上任何一點(diǎn)的斜率tanθ相等，即：
tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K
此處K即為校正常數(shù)，可用于結(jié)果計(jì)算。
通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在濃度過(guò)高和過(guò)低時(shí)往往都不呈直線(xiàn)，說(shuō)明低濃度部分亦有儀器的靈敏度和方法的檢測(cè)能力限制，所以，具體的測(cè)定就宜選擇在直線(xiàn)段濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。以此還可用于確定標(biāo)本的用量，使具有臨床意義的標(biāo)本測(cè)定結(jié)果都落在直線(xiàn)范圍內(nèi)。
（三）觀察影響顏色反應(yīng)的因素
影響顏色反應(yīng)的主要因素有：溶液pH的影響、雜質(zhì)的影響、反應(yīng)的溫度和時(shí)間、以及顏色的穩(wěn)定性等。這些都是光度法測(cè)定誤差的主要來(lái)源。都需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察并控制在一個(gè)適宜的范圍內(nèi)。從而保證方法的準(zhǔn)確性和精密性。
⒈溶液pH的影響有些溶液的顏色對(duì)pH值的改變非常靈敏。例如白蛋白在pH4左右可與溴甲酚綠結(jié)合后由黃色變成綠色，綠色的深淺與白蛋白濃度成正比，但是溴甲酚綠本身是一種pH指示劑，當(dāng)pH5.4時(shí)即由黃色轉(zhuǎn)變成綠色，在pH3.8時(shí)又由綠色變?yōu)辄S色。在白蛋白與溴甲酚綠結(jié)合顏色反應(yīng)中，如pH控制不好就很容易出現(xiàn)誤差，又如每種酶都有各自的最適pH，酶促反應(yīng)中，只有在其最適pH時(shí)才能發(fā)揮充分的催化活性。因此，在建立方法時(shí)可在不同pH值條件下（其它條件不變）令其反應(yīng)，以觀察顏色反應(yīng)的吸光度變化，從而選擇合適的pH值范圍來(lái)保證顏色反應(yīng)，以求較高的靈敏度和較好的線(xiàn)性。有時(shí)還需用相應(yīng)的pH緩沖液來(lái)維持反應(yīng)的pH，以利顏色反應(yīng)的正常進(jìn)行。
⒉雜質(zhì)的影響由于臨床生化標(biāo)本中除含待測(cè)物質(zhì)外，還含有許多非測(cè)定物質(zhì)，成分十分復(fù)雜，它們有的可與有色產(chǎn)物作用，使產(chǎn)生的顏色逐漸退去，有的與待測(cè)物質(zhì)相類(lèi)似，也能緩慢地與顯色試劑生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都會(huì)影響被測(cè)物溶液的顏色。試驗(yàn)方法是將各種可疑物質(zhì)的純?nèi)芤鹤鳂?biāo)本單獨(dú)進(jìn)行測(cè)定，如產(chǎn)生顏色反應(yīng)，這說(shuō)明該方法的特異性不高。如果將待測(cè)物質(zhì)混入可疑物質(zhì)作標(biāo)本測(cè)定，改變了被測(cè)物質(zhì)與試劑間的反應(yīng)，這是干擾（具體方法見(jiàn)第三節(jié)）。為此就需要進(jìn)一步改進(jìn)方法，或設(shè)立標(biāo)本空白，或?qū)?biāo)本作適當(dāng)處理，除去干擾物，或加入合適的干擾物掩蔽劑等，以提高方法的特異性。
⒊反應(yīng)的溫度和時(shí)間有些有色物質(zhì)能迅速反應(yīng)生成，另一些有色物質(zhì)須經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后反應(yīng)才能完全。提高反應(yīng)的溫度可以加速化學(xué)反應(yīng)，縮短反應(yīng)的時(shí)間。因此，如果在不恰當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間內(nèi)進(jìn)行比色，將會(huì)造成相當(dāng)大的誤差。這可以在不同的溫度下（如設(shè)定25℃，30℃，37℃）令其反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)吸光度來(lái)觀察各自反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間（一般達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，隨后測(cè)定的吸光度不再變化），以選定適宜臨床應(yīng)用的反應(yīng)最佳溫度和時(shí)間。
⒋穩(wěn)定性試驗(yàn)待測(cè)物質(zhì)經(jīng)顯色反應(yīng)產(chǎn)生的有色物穩(wěn)定與否，關(guān)系到測(cè)定結(jié)果的可靠性。某些有色物質(zhì)雖然生成很快，但卻不太穩(wěn)定，放置后色澤會(huì)逐步消退或起變化，有些干擾物雖不能與被測(cè)物質(zhì)同時(shí)發(fā)生顏色反應(yīng)，但當(dāng)放置一段時(shí)間后也能緩慢地與試劑顯色，使溶液顏色加深。因此，在方法建立的同時(shí)作穩(wěn)定性試驗(yàn)很有必要。試驗(yàn)的方法是用被測(cè)標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液按方法要求進(jìn)行顯色反應(yīng)后，即刻及室溫放置不同時(shí)間，分別測(cè)定其吸光度，根據(jù)其吸光度的變化確定方法穩(wěn)定的時(shí)間范圍。一般要求有色溶液能穩(wěn)定二小時(shí)以上就能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要。必要時(shí)還要加以注明。
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