臨床生物化學/反應體系的最適pH、緩沖液的種類和濃度
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固定酶反應的其它條件，在不同pH處測定酶反應速度，可得各種類型的酶活性與pH關系見圖17-3A。
圖17-3A 酶活性與pH的函數關系曲線可能具有的幾種形狀
最常見的是（a）的對稱鐘形曲線，少數的如（b）（c）在一側即偏酸或偏堿處活性最高。生化學家將酶活性最高處的pH稱為最適pH。一般來說，血清中大多數酶最適pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最適pH處活性變化尖銳明顯，也有些平坦寬廣。測定酶活性濃度時一定要選擇在最適pH處，不僅因為此處酶反應速度最大，測定靈敏度最高，還因為此處酶活性變化的斜率最小，如反應體系中出現pH變化時，對測定結果影響最小。
圖17-3B pH對酶活性及穩定性的作用
曲線A：V對pH作圖曲線B：酶先在pH5及pH8預孵育后，在pH6.8測活性
氫離子可以通過多種途徑影響酶催化反應。如在脫氫酶反應中往往需要氫離子參加，也可能產生氫離子，從理論上可以將氫離子看成是該反應的底物和產物之一。此外，當pH變化時，可影響到底物、酶、酶-底物復合物的解離狀態和構型，甚至還可能影響到各種輔因子，從而影響酶活性。
PH對酶還有一個重要的作用，就是影響酶的穩定性。圖17-3B介紹一個有關實驗。
圖中曲線A是最適pH實驗的結果，出現典型的鐘形曲線，其最適pH為6.8，高于或低于6.8時，酶反應速度下降，下降原因可能與上述諸因素有關，但也可能由于酶穩定性下降失活所致，或者是二類原因之總和。通過曲線B的實驗，可將上述二類原因分清。此時先將酶與不同pH底物緩沖液溫育一段時間，此時間一般與測定時間相當，然后再將pH調回最適pH處測其活性。從曲線B可以說在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之間酶活性的下降與酶滅活關系不大，酶在最適pH處儲存常數穩定。但有些酶貯存在最適pH時，并不一定比在其它pH處更穩定。
最適pH并非是酶的特征性常數，易受多種因素影響而改變，如緩沖液的種類、底物濃度、溫度等，在研究pH對酶穩定性影響還應注意到酶濃度高低，在低濃度時，酶易解離為單體，常比多聚體更易滅活。還應注意試劑中各種防腐劑和其它添加劑的影響。
最后必須強調的是本節討論的pH并不是指底物緩沖液的pH，而是底物和標本混合后的pH對反應速度的影響，由于實驗室所測的標本很少是純酶樣品，多為體液或組織粗提液。它們也是有一定pH值和緩沖能力的緩沖液，和底物緩沖液混后后，不一定維持住原來pH，特別是當二溶液的pH相差甚遠時，變化更大。例如堿性磷酸酶最適pH為10.2，雖然底物pH也是10.2，但血清標本pH為中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取決于血清的pH和緩沖能力。從而影響酶測定結果，臨床觀察證實：當血清標本放置過夜后用金氏法再測堿性磷酸酶時，結果常升高。有人認為這與血清放置過長，由于CO2逸出引起血清pH偏堿有關。
在下列情況極易引起混合液pH偏離底物緩沖液的pH：一是標本用量太大，如以前有些方法，為節省底物，底物緩沖液用量和血清用量相等，此時混合液pH可能在此二液pH之間，有可能引起較大測定誤差。所以在文件中規定“標本在總體積中的比例應在10％以下”。就是要盡量減少標本中各種物質對測定結果的影響。二是底物緩沖液緩沖能力太低。如金氏法測堿性磷酸酶時使用的碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，濃度這樣低的緩沖液，必定要受標本pH的影響。
過去長期以來，認為緩沖液作用就是維持酶反應的最適pH，忽視了緩沖物質對酶反應的其它作用和影響，Howell等研究了酶活性在三種不同緩沖液的變化情況見圖17-4。
圖17-4 各種緩沖液的溫度及pH的關系
TRIS：三羥甲基氨基甲烷0.1mol/L
TRA：三乙醇胺0.1mol/L
三種不同緩沖液不僅最適pH不一樣，最大反應速度也有差異，從測定酶活性濃度角度，應該選用枸櫞酸緩沖液，類似現象在大多數酶都能觀察到，僅是程度不同，其中以堿性磷酸酶活性受到緩沖液種類影響最為顯著，在二乙醇胺緩沖液所測酶活性約比在碳酸鹽緩沖液所測的高2倍。
由于緩沖液含有大量離子，或影響酶蛋白的構型，或影響底物的解離程度等等，從而影響酶活性。Allert曾擬定了一種作用模式，并進行數學計算，得出相應方程式來說明反應體系中電解質會影響最大反應速度V，且不同濃度電解質的影響有差異。因此在方法設計時，選完緩沖物質后，還必須了解不同濃度緩沖液對酶活性的影響。一般而言，隨緩沖液濃度增加，電解質干擾酶和底物結合，酶活性將逐步下降，所以選擇緩沖液濃度時，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度較低以免抑制酶活性兩個相矛盾作用之間取得平衡。
在目前酶測定常用的一大類所謂生物緩沖物質，如圖中的Tris、三乙醇胺受溫度影響較大。因此在我國學會文件中指出“配制緩沖液時不僅要指出其pH值，還應說明配制溫度，以避免因溫度不同而引起的誤差。”在此圖中還可看到，即使是同一種緩沖液，隨其它物質存在，也有可能改變溫度的影響。因此在實際配制緩沖液時，應首先將配制溶液溫度調節到規定溫度，然后在pH計監測下加入相應的酸或堿將溶液pH調到要求范圍。不控制溫度，不用pH計盲目按一些書提供的量配制緩沖液是不可取的。
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