脈沖場(chǎng)凝膠電泳
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（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子（>10kb）移動(dòng)速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。在脈沖場(chǎng)凝膠電泳中，電場(chǎng)不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個(gè)方向）變動(dòng)。DNA分子帶有負(fù)電荷，會(huì)朝正極移動(dòng)。相對(duì)較小的分子在電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動(dòng)方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DNA分子?！ ?/p>
目錄 |
高分子量DNA瓊脂糖凝膠塊制備和加工
1．收集10ml全血，加入30ml細(xì)胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細(xì)胞完全溶解。
2．2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細(xì)胞裂解液洗滌細(xì)胞，然后用PBS重懸細(xì)胞。
3．稀釋單細(xì)胞懸液并取一小份用Neubauer腔計(jì)數(shù)細(xì)胞。
4．用PBS重懸細(xì)胞，以達(dá)到40μl PBS中含1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞比例（1百萬(wàn)個(gè)倍體哺乳動(dòng)物大約含有基因組DNA 10μg）
5．用PBS配制2％濃度低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液并保持在50℃。
6．將等體積（各1ml）細(xì)胞懸液與瓊脂糖溶液于室溫下混勻，立即倒入凝膠塊模具中。
7．靜置20min讓瓊脂糖固化，用無(wú)菌塑料杯（通常用作劃菌）將凝膠塊自模具中取出并置入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩沖液于50℃保持2～3天。每個(gè)盛有50ml蛋白酶緩沖液的Falcon管可容納多達(dá)100個(gè)凝膠塊。
9．蛋白酶K消化后，可將凝膠塊保留在此緩沖液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10． 此外，繼續(xù)將凝膠塊用高壓消毒過(guò)的TE緩沖液沖洗數(shù)遍的步驟。
11． 將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶K。
12． 室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數(shù)次，將凝膠塊放入另一干凈的試管，可直接用于酶切反應(yīng)或用0.5mol/L
EDTA，（pH8.0）4℃保存凝膠塊。
13． 若用EDTA保存凝膠塊，取出后應(yīng)用TE溶液室溫下漂洗30 min×2次?！ ?/p>
大小標(biāo)準(zhǔn)物的制備
λ多聯(lián)體
1．以TE緩沖液懸浮λ多聯(lián)體（Boehringer MA寶靈曼公司產(chǎn)品），濃度為4μg/40μl。
2．用等體積TE配制的2％低熔點(diǎn)瓊脂糖（溫度保持在45℃）混勻。
3．移去混合液注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。
4．室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天?！ ?/p>
酵母染色體
1．從YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培養(yǎng)基瓶皿中挑選單一克隆加入10ml
YPD預(yù)培養(yǎng)的肉湯中，30℃下劇烈震蕩生長(zhǎng)24小時(shí)，然后加入200ml YPD肉湯，劇烈振蕩24～48h（產(chǎn)量大約100塊）。
2．4000×g轉(zhuǎn)速，離心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。
3．仍以4000×g轉(zhuǎn)速離心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸鈉，pH5.8及10 mmol/L
EDTA (pH7.5)]溶液重懸。
4．取稀釋后的細(xì)胞懸液用Neubauer腔計(jì)數(shù)。
5．溶液短暫離心后，再用SCE重懸細(xì)胞，使40μl SCE溶液中含5×107個(gè)細(xì)胞（相當(dāng)于80μl體積的模塊中含有5×107個(gè)細(xì)胞）。
6．溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15～30min。
7．細(xì)胞懸液與等體積的SCE配制的2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。
8．將混合物移注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。
9．凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1～2小時(shí)。
10． 將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃溫育48h。
11． 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次，每次min。
12． 凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中?！ ?/p>
瓊脂糖凝膠塊中DNA的限制性內(nèi)切酶消化
1．應(yīng)使用消毒溶液及戴無(wú)菌手套以免DNA降解。
2．在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min 3次，以去除EDTA。
3．混合：酶反應(yīng)緩沖液（高、中或低鹽緩沖液），100
mmol/L亞精胺（只用于高鹽緩沖液狀態(tài)），10～20單位的內(nèi)切酶。20單位的內(nèi)切酶就足以過(guò)夜完全消化10μg DNA。
4．設(shè)立一個(gè)除內(nèi)切酶成分外含有混合物各組分的陰性對(duì)照，以檢查是否有非特異性DNA降解。
5．將瓊脂糖凝膠塊加入反應(yīng)混合溶液中：通常用消毒過(guò)的手術(shù)刀或套環(huán)將凝膠塊移入。
6．若兩種內(nèi)切酶所需緩沖液條件一致，可以同時(shí)或先后用兩種不同的酶進(jìn)行消化（先用低鹽緩沖液的酶消化，再調(diào)整鹽濃度）。倘若首次消化的酶要求50℃條件，在第二個(gè)酶消化時(shí)要換緩沖液。
7．若要進(jìn)行部分消化，則首先在同一溫度和反應(yīng)時(shí)間用1：10稀釋的酶進(jìn)行嘗試?！ ?/p>
凝膠電泳
1．將0.8％的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化后冷卻至50～60℃，立即注入凝膠框架中，并插入梳子。
2．凝膠固化后小心地拔出齒梳，用2把無(wú)菌手術(shù)刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內(nèi)切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時(shí)應(yīng)將手術(shù)刀片燒灼后冷卻。將DNA大小標(biāo)志物上樣至凝膠的兩旁。
3．用1％液態(tài)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠（0.25×TBE配制）密封狹槽。
4．若有氣泡存在，用注射器驅(qū)趕氣泡。
5．一旦密封的低熔點(diǎn)瓊脂糖已固化（大約10min），可將凝膠擱入腔室，并用電泳緩沖液覆蓋過(guò)膠面。
6．應(yīng)設(shè)定合適的電壓及轉(zhuǎn)換時(shí)間（參考《分子醫(yī)學(xué)技術(shù)》84頁(yè)表8.1）并開始電泳。兩個(gè)不同電泳方向的電流應(yīng)相等。
7．電泳結(jié)束后，凝膠用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。
8．用泵自槽中排除緩沖液，續(xù)以雙蒸水沖洗電泳槽。
9．凝膠成像：DNA在曝光的過(guò)程中可能會(huì)形成缺口。
10． 用0.25mol/L HCl漂洗凝膠30min，讓DNA脫嘌呤，并有利于轉(zhuǎn)移。
11． 凝膠用堿（變性溶液中）變性20min，兩次，續(xù)以中性溶液1～5min。
12． 采用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方案將DNA轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。一般來(lái)說(shuō)，印跡PFGE凝膠的時(shí)間較普通凝膠印跡時(shí)間長(zhǎng)（約48h）。
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