生物化學與分子生物學/質粒載體

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生物化學與分子生物學

DNA重組與基因工程
- 基因工程載體
  - 質粒載體
  - 噬菌體載體
  - 動物病毒載體

質粒（plasmid）是細菌或細胞染色質以外的，能自主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下：

①是染色質外的雙鏈共價閉合環形DNA（covalentlyclosed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質粒比較容易分離純化，＞15kb的大質粒則不易提取。

②能自主復制，是能獨立復制的復制子（autonomous replicon）。一般質粒DNA復制的質粒可隨宿主細胞分裂而傳給后代。按質粒復制的調控及其拷貝數可分兩類：嚴緊控制（stringent control）型質粒的復制常與宿主的繁殖偶聯，拷貝數較少，每個細胞中只有1個到十幾個拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control）型質粒，其復制宿主不偶聯，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。每個質粒DNA上都有復制的起點，只有ori能被宿主細胞復制蛋白質識別的質粒才能在該種細胞中復制，不同質粒復制控制狀況主要與復制起點的序列結構相關。有的質粒的可以整合到宿主細胞染色質DNA中，隨宿主DNA復制，稱為附加體，例如細菌的性質粒就是一種附加體，它可以質粒形式存在，也能整合入細菌的DNA，又能從細菌染色質DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質能使兩個細菌間形成纖毛狀細管連接的接合（conjugation），通過這細管遺傳物質可在兩個細菌間傳遞。

③質粒對宿主生存并不是必需的。這點不同于線粒體，線粒體DNA也是環狀雙鏈分子，也有獨立復制的調控，但線粒體的功能是細胞生存所必需的。線粒體是細胞的一部分，質粒也往往有其表型，其表現不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質粒攜帶的基因功能有利于宿主細胞的特定條件下生存，例如，細菌中許多天然的質粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質粒稱為抗藥性質粒，又稱R質粒，帶有R質粒的細菌就能在相應的抗生素存在生存繁殖。所以質粒對宿主不是寄生的，而是共生的。醫學上遇到許多細菌的抗藥性，常與R質粒在細菌間的傳播有關，F質粒就能促使這種傳遞。

pBR322及pUC18圖譜

圖20-2　pBR322及pUC18圖譜

現在分子生物學使用的質粒載體都已不是原來細菌或細胞中天然存在的質粒，而是經過了許多的人工的改造。從不同的實驗目的出發，人們設計了各種不同的類型的質粒載體，近年來發展很快，新的有特定用途的質粒不斷被創建。圖20-2給出最常用的大腸桿菌克隆用質粒pUC19的圖譜，此質粒的復制起點處序列經過改造，能高頻率起動質粒復制，使一個細菌pUC19的拷貝數可達500-700個；質粒攜帶一個抗氨芐青霉素基因，編碼能水解β-內酰胺環，從而被壞氨芐青霉素的酶，當用pUC19轉化細菌后放入含氨芐青霉素的培養基中，凡不含pUC19者都不能生長，結果長出的細菌就是都含有pUC19的；pUC19還攜帶細菌lac操縱元中的lacI和lacZ基因編碼，β-半乳糖苷酶N端狀146個氨基酸的段落，當培養基中含有誘導物IPTG和Xgal時，lacz ' 基因被誘導表達產生的β-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達的C端肽互補而具有β-半乳糖苷酶活性（質粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為α-互補，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現藍色；在lacz '中間又插入了一段人工設計合成的DNA序列，其中密集多個常用的限制性核酸內切酶的位點，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當外來序列插入后則破壞了lacz '編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這種顏色標志的變化就很容易區分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉化菌落，稱為藍白篩選法。