基因擴(kuò)增
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基因擴(kuò)增(gene amplification)
細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA, 產(chǎn)生大量的拷貝。如兩棲類卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍。基因擴(kuò)增是通過形成幾千個核進(jìn)行的，每個核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母細(xì)胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達(dá)到50萬個，而在相同生物的其它類型細(xì)胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個。卵母細(xì)胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。
至于卵母細(xì)胞中rRNA基因擴(kuò)增的機(jī)制，有人認(rèn)為可能是通過從染色體上分離出來的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)的方式進(jìn)行復(fù)制，因而能夠產(chǎn)生大量的rRNA基因。
為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。在自然條件下，基因擴(kuò)增是通過從染色體切除基因的重復(fù)序列再在質(zhì)粒中進(jìn)行染色體外復(fù)制或通過將核糖體RNA的全部重復(fù)序列生成RNA轉(zhuǎn)錄物再轉(zhuǎn)錄生成原來DNA分子的額外拷貝而實現(xiàn)的。在實驗室已建立了不等交換、從裂解細(xì)胞提取DNA或經(jīng)過滾環(huán)復(fù)制（rolling circle replication）生成染色體外序列進(jìn)行人工基因擴(kuò)增。例如，在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個拷貝，在減數(shù)分裂Ⅰ的粗線期，這個基因開始迅速復(fù)制，到雙線期它的拷貝數(shù)約為200萬個，擴(kuò)增近4000倍，可用于合成10的12次方個核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質(zhì)的需要。在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了基因擴(kuò)增現(xiàn)象。 在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生卵殼蛋白的基因被擴(kuò)增。果蠅中的卵原細(xì)胞，經(jīng)4次分裂產(chǎn)生16個細(xì)胞，其中一個是卵母細(xì)胞（oocyte），將發(fā)育成為卵細(xì)胞，其他15個是營養(yǎng)細(xì)胞（nurse cell），它們?yōu)槁鸭?xì)胞的形成提供大量的蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)，營養(yǎng)細(xì)胞之所以能夠產(chǎn)生大量的營養(yǎng)物質(zhì)，是因為它們在形成的過程中發(fā)生了多次特殊的DNA復(fù)制，卵殼蛋白等基因拷貝數(shù)顯著增加。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍（圖4）,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。
PCR：聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
PCR是在體外由酶促合成特異DNA片段的一種新方法。在反應(yīng)液中含有模板DNA、人工合成的目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四種脫氧核苷酸底物（dNTP）、一種耐熱的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各種離子的緩沖液。此反應(yīng)體系由高溫變性、低溫復(fù)性及適溫延伸等步驟共同組成一個周期，然后反復(fù)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是，待擴(kuò)增的模板DNA在94℃高溫下解鏈成為單鏈DNA；低溫復(fù)性時人工合成的兩個寡聚核苷酸引物分別與目的片段兩條鏈的兩端互補(bǔ)結(jié)合；在72℃時Taq酶可將dNTP從引物3′端開始摻入，沿模板DNA5′→3′方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。由于每一周期所產(chǎn)生的新DNA鏈均能成為下一循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)過25~30個周期后，一般可擴(kuò)增至106~107。PCR技術(shù)由于有操作簡便、省時間、特異性及敏感性均較高等特點，所以一經(jīng)問世，就得到了廣泛的應(yīng)用，許多條件較差的實驗室，也得以開展分子生物學(xué)研究，故可看作是分子生物學(xué)技術(shù)的一次革命。在PCR反應(yīng)的各種成分中，模板DNA和引物是兩個重要因素，雖然PCR敏感性很高，可以檢測微量DNA的用量，以不低于0.1μg為宜。模板DNA的純度要求不是很嚴(yán)格，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及Taq酶抑制劑。引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物長度以15~30個堿基為宜；（G+C）約占總堿基中的50%；兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)；應(yīng)盡量減少重復(fù)的堿基，特別是在3′端。PCR可用于擴(kuò)增DNA或RNA。在擴(kuò)增RNA時必須先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行PCT擴(kuò)增，這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。目前PCR技術(shù)在腫瘤研究中也得到廣泛的應(yīng)用。例如從腫瘤細(xì)胞提取基因組DNA然后用設(shè)計好的對某個基因特異的OCR引物，如p53基因第5~8外顯子的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用單鏈DNA構(gòu)型多態(tài)性（SSCP）分析技術(shù)或直接DNA測序技術(shù)，研究p53基因的點突變。RT-PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測某個癌基因、抑癌基因或其他腫瘤相關(guān)基因的過度表達(dá)或低表達(dá)。
PCR技術(shù)基本原理
PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引 物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
PCR技術(shù)簡史
PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實現(xiàn)
1985年國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進(jìn)與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之 間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點，但由于 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效 率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。
PCR的反應(yīng)動力學(xué)
PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%， 但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn) 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情 況下，平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所 結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合 時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的 “短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
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