原代培養(yǎng)
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原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
目錄 |
基本介紹(primary culture)
原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，嚴(yán)格的說(shuō)即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實(shí)際上，通常把第一代
至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
分類
最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。
分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細(xì)胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和膠原酶）消化細(xì)胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑（如EDTA）除去細(xì)胞互相粘著所依賴的Ca2+，再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩，使之成為單細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
能獨(dú)立地進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng)，爭(zhēng)取原代培養(yǎng)一次成功。
實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段，同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的化療藥物的敏感性來(lái)幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。原代培養(yǎng)可分為消化法和組織塊培養(yǎng)法，這里統(tǒng)一作介紹。
實(shí)驗(yàn)材料和用品
材料：培養(yǎng)瓶，青霉素瓶，小玻璃漏斗，三角燒瓶，平皿，吸管，試管，移液管，無(wú)菌紗布，無(wú)菌眼科剪，廢液缸，血球計(jì)數(shù)板，蠟盤，手術(shù)器械，大頭針，離心管。孕鼠或新生1。4d乳鼠，75％酒精棉球，2％碘酒。
藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．125％胰蛋白酶，Hanks液，75％酒精，雙抗(青霉素和鏈霉素)。
儀器(請(qǐng)參看儀器圖庫(kù))：CO2培養(yǎng)箱．；倒置顯微鏡，超凈臺(tái)，磁力攪拌器，離心機(jī)。
實(shí)驗(yàn)步驟
1．取材(以胚胎小鼠為例)：將孕鼠拉頸椎處死，投入75％酒精浸泡數(shù)秒消毒，提出孕鼠控掉酒精，放置于蠟盤中用大頭針固定。用手術(shù)器械逐層分離皮膚和肌肉組織，打開(kāi)腹腔。注意不同的解剖層次使用不同的消毒器械。最后取出雙角子宮置于無(wú)菌平皿內(nèi)。
2．用Hanks液洗滌3次，剪開(kāi)子宮取出胚胎。除去子宮、血液和筋膜等組織。
3．用彎頭剪把胚胎盡量剪碎，每個(gè)組織塊小于1mm3。在操作時(shí)應(yīng)盡量將平皿蓋半蓋住平皿以防空氣中塵埃落下污染組織。再用Hanks液洗滌2-3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按兩種方法進(jìn)行，即消化法和組織塊培養(yǎng)法。
4．若使用消化法，則將組織塊放人三角燒瓶?jī)?nèi)加入10-30mL0．125％胰蛋白酶，37℃磁力攪拌消化20多min。然后加人少量血清終止消化。用幾層無(wú)菌紗布過(guò)濾。取過(guò)濾液，800r／min離心5-10min收集細(xì)胞。棄上清，加入帶有雙抗的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
5．若進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，則不做步驟4，加入幾滴血清于組織塊中，再用彎頭吸管將組織塊懸液吸起。在一小培養(yǎng)瓶中逐個(gè)鋪展開(kāi)，注意將瓶底涂抹均勻。將瓶子翻轉(zhuǎn)倒置后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置2-3h。待組織塊微干與瓶壁粘牢后再輕輕將瓶子翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，從邊角加入4-5mL培養(yǎng)基，使細(xì)胞接觸到培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
操作要領(lǐng)
混勻操作要領(lǐng)
（1）火焰消毒吸管，用Hanks液冷卻和濕潤(rùn)管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘在管壁上）
（2）吸管頭插入管底
（3）用吸管反復(fù)輕輕吹打組織塊
器械的使用
（1）用工作臺(tái)消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。
（2）器械置無(wú)菌干紗布內(nèi)嚓一下。迅速通過(guò)火焰，冷卻后使用。
（3）用過(guò)的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。
（4）器械按浸泡消毒的順序使用。
（5）各套再消毒器械不可混用。
除去組織塊多余水分
用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。
注意：多余水分若不除去，會(huì)使組織塊剪切不細(xì)，消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少），并可見(jiàn)消化液中消化液中有線狀或絮狀物漂浮。
細(xì)胞計(jì)數(shù)
（1）用吸管混勻待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液。
（2）將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中。
（3）沉降1分鐘，低倍鏡下計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四大中格的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1。
（4）計(jì)數(shù)時(shí)，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計(jì)算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。
（四大中格細(xì)胞數(shù)/4）*10000=細(xì)胞數(shù)/毫升
注意事項(xiàng)
一、注意污染
1、嚴(yán)格進(jìn)行動(dòng)物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動(dòng)物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。
3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液體時(shí)，避免倆這碰撞。
4、離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)消毒。
5、實(shí)驗(yàn)者離開(kāi)超凈臺(tái)時(shí)，要隨時(shí)用肘部關(guān)閉工作窗。
6、使用過(guò)的器械用酒精棉球嚓去血污后，移入另一個(gè)器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時(shí)剪刀口要叉開(kāi)放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。二、器材使用時(shí)既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。
三、超凈臺(tái)內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時(shí)臺(tái)內(nèi)散熱更慢，因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時(shí)，離火焰要稍微遠(yuǎn)些。
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