醫學遺傳學/遺傳病的基因診斷舉例

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醫學遺傳學基礎

基因診斷
- 遺傳病的基因診斷選擇
  - 直接診斷和間接診斷
  - 基因異常與診斷方法的選用
  - 遺傳病的基因診斷舉例

1．基因缺失型遺傳的診斷

（1）α地貧的基因診斷：α地貧主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1－4個。正常基因組用BamHⅠ切割，可以得到一個kb的片段，而缺失一個α基因時切點向5’端移位，得到一條10kb的片段。因此，當用α基因探針與基因組DNA進行Southern雜交時（圖13-8），在α地貧₂可見一條14kb和一條10kb的帶，在正常人可見一條雙份的14kb的帶，而在α地貧₁則見一條單拷貝的14kb帶，血紅蛋白H病時只有一條10kb的帶的，而在Barts水腫胎時，則無任何雜交帶。

圖13-8 α地貧基因缺失的診斷

左圖：16號染色體上攜有數目不同的基因

右圖：α基因探針雜交的結果

箭頭：BamHⅠ切點

一種較簡便的方法是直接用α探針進行斑點雜交，自顯影后根據斑點深淺的不同也可以對α地貧作出診斷。更為簡單的方法是PCR診斷，即在α基因缺失范圍內設計一對引物，然后PCR擴增胎兒的DNA，如為Barts 水腫胎，則無擴增產物，電泳后無任何帶紋，從而可建議進行人工流產，但此法不能診斷其它類型的地貧（除非另設計引物用作PCR）。

（2）DMD／BMD的缺失型診斷：DMD／BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經肌肉系統受累的致死性遺傳病（參閱第四章）。DMD／BMD有70％左右為缺失型。此基因很大，缺失可發生在不同部位，因此應盡可能采用多對引物作PCR擴增（多重PCR）來檢測。如擴增產物電泳后發現有帶紋的缺失，即可作出診斷并對缺失定位（圖13-9），在進行產前診斷時，一般可先通過檢測家系中有關成員，即確定先證者的缺失區，然后有針對性地作PCR擴增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。

2．點突變型遺傳病的基因診斷2

（1）鐮形細胞性貧血的基因診斷：已知突變基因是編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變為GTG，從而使纈氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法進行診斷。

圖13-9 DMD基因缺失的多重PCR診斷

exon：外顯子；pm:啟動子；1：正常9條帶；2：基因全缺失；3：啟動子區缺失；4：第3外顯了缺失；5：第13外顯子缺失；6：第47外顯子缺失；7：47－52外顯子區段缺失；8：第52外顯子缺失

1）RFLP診斷：已知限制酶MstⅡ切割的識別順序是CCTNAGG，它能切割正常β鏈中CCTGAGG序列，但不能切割突變了的CCTGTGG（A→T）。這樣，由于突變消除了一個切點，使內切酶長度片段發生了改變，通過電泳，就可以區別正常的β^A和β^S（圖13-10）。

圖13-10 鐮狀貧血的基因診斷

除MstⅡ外，限制酶DdeⅠ（識別序列為CTNAG）也能夠把正常的β^A基因與鐮變了的β^S基因區別開來，并用于診斷。

2）ASO探針診斷：由于突變部位和性質已完全明了，也可以合成寡核苷酸探針，用³²P標化來進行診斷。此時需要合成兩種探針，一種與正常β^A基因序列完全一致，能與之穩定地雜交；另一種與突變基因序列一致，能與β^S基因穩定雜交，但不能與正常的β^A基因雜交。根據雜交結果，就可以把發生了突變的β^S基因檢測出來。

PCR技術問世以來，ASO診斷又有新的改進，即先PCR擴增長約110bp的基因片段，然后再與ASO探針雜交。這樣可減少目的基因DNA用量，并降低與基因組DNA雜交時的非特異性信號。

3．基因異常不明的遺傳病的診斷

成年型多囊腎病（adult polycystic kidney disease,APKD）是一種常染色體顯性遺傳病，發病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現多發性囊腫，臨床表現為腰疼、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結石等，最終可導致腎功能衰竭和尿毒癥。本病基因定位在16p13，與α珠蛋白基因3’端相鄰，但致病基因尚未克隆，基因產物的生化性質和疾病發病機理也尚未闡明。因此，目前只能用連鎖分析來進行基因的發病前診斷和產前診斷。由于通過家系分析，已證實APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)緊密連鎖，而后者在人群中具有高度多態性，因此可以通過RFLP連鎖分析進行診斷（圖13-11）。

圖13-11 成年型多囊腎病的連鎖分析診斷

從圖13-11可見，當用3’HVR作為探針與PvuⅡ酶切后的家系有關成員基因組DNA雜交時，可見有5.7、3.4和2.4kb的3種等位片段。患者的母親有5.7和3.4kb兩種片段，父親為2.4kb純合子，其子女凡有3.4片段者為患者，而凡無此片段者都不是患者。因此可知致病基因伴隨3.4kb等位片段分離，即與之相連鎖。圖中Ⅱ₅的DNA檢查只有5.7和2.4kb而無3.4kb片段，故不是患者或致病基因攜帶者。