醫學遺傳學/聚合酶鏈反應

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醫學遺傳學基礎

基因診斷
- 常用基因診斷技術
  - Southern印跡法
  - 聚合酶鏈反應
  - 擴增片段長度多態性
  - 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
  - 單鏈構象多態性診斷法

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。PCR反應的原理如圖13-7。

PCR原理示意圖黑色線代表引物

圖13-7 PCR原理示意圖黑色線代表引物

由圖可見，首先應按照欲檢測的DNA的5’和3’端的堿基順序各合成一段長約17-20余個堿基的寡核苷酸作為引物（primer），其次是將待檢測的DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP）、引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴增的DNA鏈復性結合，然后的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成了兩條雙鏈。若繼續按照變性（92－95℃）→復性（40－60℃）→引物延伸（65－72℃）的順序循環20至40個周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環20周期可使DNA擴增2n，即100余萬倍。PCR反應特異性強，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴增的模板得到大量的擴增片段。毛發、血痕，甚至單個細胞的DNA即可供PCR擴增之用。因此它用于病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細胞的檢出、罪犯或個體遺傳物質的鑒定以及遺傳病的基因診斷等。

目前已可對一系列的遺傳病進行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如α地貧），則在缺失兩端設計一對引物進行擴增，就不會得到擴增產物或只能得到縮短了的擴增產物。如果疾病是由點突變引起的，而突變的位置和性質已知，則在設計引物時使之包括突變部位，由于突變后的堿基不配對，結果無擴增片段；或者在引物設計時于其3’端設計一個錯誤的核苷酸，使之與突變了的核苷酸配對，其結果是正常引物不能擴增，而用錯誤的引物能擴增，從而可對突變的存在作出判斷。

PCR技術目前有許多新的發展，用途日益擴大。例如，可用RNA為模板經過逆轉錄再行擴增的RT－PCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結果得到大量單鏈產物，稱為不對稱PCR，其單鏈產物可用于序列分析；在一個反應中加入多對引物同時檢測多個部位的多重PCR等等。