臨床生物化學/載脂蛋白測定

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臨床生物化學

血漿蛋白及其代謝紊亂
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  - 載脂蛋白測定

血清載脂蛋白（Apo）包括ApoAⅠ、AⅡ、B₁₀₀、CⅡ、CⅢ、E和（a），已屬常規檢測項目。血清中載脂蛋白均結合于脂蛋白中，測定時要加用解鏈劑，使脂蛋白中Apo暴露再進行測定。

目前測定血清中Apo的含量的方法是利用相應特異抗體試劑進行測定。現有羊抗人ApoAⅠ、AⅡ、B₁₀₀、CⅡ、CⅢ、E和(a)等抗體試劑。測定原理是將某一特異抗體加到待測人血清中，即與血清中相應抗原形成抗原抗體復合物，根據復合物的量，即可測出血清中某一Apo含量。例如在人血清中加入抗人ApoAⅠ抗體，即與血清中ApoAⅠ（抗原）結合形成復合物，再定量即可測出血清中ApoAⅠ含量。

⒈免疫擴散法先制備含Apo抗體的瓊脂糖凝膠，間隔等距離打孔，加入待測人血清，水平置于溫箱（37℃）保溫24或48h，抗原從孔中間向周圍擴散，因凝膠板中有相應抗體，經一定時間擴散后，最后在凝膠孔周圍形成一圓型沉淀圈，測量其圓直徑，以圓的面積大小計算血清中Apo含量。該法要求在測量圓周大小時，一定要精確到0.1mm。這一測定方法可適用于以抗體為試劑販所有微量蛋白的測定，但易受多種因素的影響，難以測準，有淘汰的趨勢。

⒉免疫火箭電泳先制備含某一Apo抗體的瓊脂糖凝膠，靠近陰極端打孔，加入待測血清，進行電泳。血清中Apo抗原往正極移動，一定時間（約3h）后，即可形成類似火箭的沉淀峰，根據火箭峰高度或面積的大小計算血清中Apo含量。在嚴格掌握電泳條件下，本法是一種較為簡便、試劑用量少的好方法。

⒊免疫比濁法免疫比濁法分為免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。

Apo的特異抗體與血清中相應的抗原結合形成抗原抗體免疫復合物，并形成微細顆粒，混懸于溶液介質中，光線通過這種渾濁介質溶液時被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比。在抗體量一定的條件下，抗原越多，抗原抗體復合物越多，溶液越渾濁，吸收光越多，以此對抗原進行定量，這種通過測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。該法是目前使用最為廣泛的方法，快速準確，可在自動生化分析儀上作批量檢測。

當光線通過含抗原體復合物的渾濁介質溶液的混懸顆粒時，出現光散射作用，散射光強度與溶液中混懸顆粒的量成正比，這種測定光散射強度的方法稱為免疫散射比濁法。該法的進行，需要有具備測定散射光的儀器如散射比濁儀等。

免疫比濁時，由于抗原與抗體結合的過程中，吸收度與濃度之間不呈線性關系，一般是三次程曲線關系。若要將抗原與抗體兩個變量之間的變動特征恰當地反映出來，需要經過三次程擬合成近似直線化的曲線方程，再進行運算。免疫比濁的實際操作過程中，可采用終點法或速率法，用五點或七點不同濃度進行定標，經三次曲線方程擬合求出一條能反映真實情況的濃度與吸光度的關系曲線方程，作為定量的工作曲線。如果以單一標準濃度定標，以一次方程直線回歸運算，所測結果僅在標準濃度上下波動，真正的過低和過高值無法測準。

免疫比濁法所用抗體應是單價、特異并且高效價的，尤其是抗體若非單一而混有少量其他蛋白抗體，在血清中形成的復合物將是一種大雜燴，非單一蛋白的復合物，測出結果偏高而不準確。